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今天分享的文獻(xiàn)題目是：Hypoxia alters the response to anti-EGFR therapy by regulating EGFR expression and downstream signaling in a DNA methylation-specific and HIF-dependent manner，影響因子為9.728分，發(fā)表在Cancer Res.雜志上，發(fā)表時(shí)間為2021年5月。

該文章主要探究了：缺氧條件下的部分乳腺癌細(xì)胞，通過DNA甲基化的作用機(jī)制，降低了HIF-1α在EGFR基因上結(jié)合位點(diǎn)的甲基化水平，從而促進(jìn)了EGFR的表達(dá)，在這種情況下，EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的敏感性更強(qiáng)。

本篇文章的研究背景是這樣的：缺氧可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，作者的近期研究表明缺氧對(duì)一些保守基因有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，此文獻(xiàn)中選擇了表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)作為研究對(duì)象；EGFR在癌癥中過表達(dá)，參與激活多條信號(hào)通路，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著不容忽視的作用；正常情況下，EGFR的表達(dá)主要受其mRNA的調(diào)節(jié)，在膠質(zhì)瘤中也以此機(jī)制調(diào)控其表達(dá)，但在其它實(shí)體瘤中mRNA調(diào)節(jié)其表達(dá)不常見；已有文獻(xiàn)表明，在多種癌癥中，EGFR啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化改變了EGFR的表達(dá)情況；然而，EGFR低甲基化是否以及如何改變基因表達(dá)，還沒有被研究過。因此，此篇文獻(xiàn)作者著眼于在乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)的EGFR的作用機(jī)制的研究和探討。

接下來通過作者得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來分析這篇文章吧!

一、缺氧條件下，EGFR表達(dá)在部分乳腺癌細(xì)胞株中被誘導(dǎo)

在作者的前期工作中，對(duì)31種乳腺癌細(xì)胞株在20%或1%氧氣條件下暴露24小時(shí)進(jìn)行了RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)每株細(xì)胞株中均有1000個(gè)以上基因被誘導(dǎo)或抑制，但只有42個(gè)基因?qū)Φ脱跽T導(dǎo)起保守效應(yīng)，其中就包括在部分乳腺癌細(xì)胞株高表達(dá)的EGFR。為了確認(rèn)這一結(jié)果，作者在這里也通過qPCR檢測(cè)了低氧誘導(dǎo)后31株乳腺癌細(xì)胞株中EGFR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有7株細(xì)胞中的EGFR表達(dá)被誘導(dǎo)了2倍甚至更高（Fig.1A）。接下來選擇了6株管腔細(xì)胞系和5株基底細(xì)胞系來檢測(cè)EGFR表達(dá)情況，6株管腔細(xì)胞系的EGFR在缺氧條件下全部被誘導(dǎo)，而基底細(xì)胞系只有1株細(xì)胞被誘導(dǎo)（Fig.1B-D）?？紤]到管腔細(xì)胞表達(dá)雌激素受體（ER），而基底細(xì)胞不表達(dá)，推測(cè)ER可能影響了EGFR的表達(dá)。在缺氧條件下，采用4-羥基他莫昔芬(OHT)或氟哌啶醇抑制ER，或采用ER cDNA過表達(dá)ER，都未能影響EGFR的表達(dá)（補(bǔ)充材料）。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到，管腔(ER+)或基底(ER-)乳腺癌樣本患者中，EGFR表達(dá)與缺氧評(píng)分表達(dá)相關(guān)，從而排除ER對(duì)EGFR表達(dá)的影響。以上結(jié)果說明，在缺氧條件下，只有部分乳腺癌細(xì)胞株中EGFR表達(dá)被誘導(dǎo)，且跟ER無關(guān)。

二、缺氧條件下，EGFR表達(dá)被誘導(dǎo)依賴于HIF-1α

腫瘤細(xì)胞生存和適應(yīng)缺氧條件，部分是通過激活缺氧誘導(dǎo)因子1 (HIF-1)和HIF-2，誘導(dǎo)參與血管生成、葡萄糖利用、侵襲和轉(zhuǎn)移的基因產(chǎn)物的表達(dá)，因此，推測(cè)HIFs可能影響了EGFR的表達(dá)。采用CRISPR技術(shù)敲除HIF-1α和HIF-2α，結(jié)果得到，缺氧條件下誘導(dǎo)的EGFR高表達(dá)效應(yīng)被敲除HIF-1α阻斷了，而敲除HIF-2α對(duì)EGFR表達(dá)沒有影響（Fig.2A-B），說明EGFR的表達(dá)依賴于HIF-1α。接著，作者探究了EGFR下游通路的影響。在缺氧和正常氧氣條件下，EGF刺激30分鐘后AKT和ERK的磷酸化水平均增加（Fig.2C）， 在缺氧條件下，敲除HIF-1α或加入EGFR抑制劑后，阻斷了AKT和ERK的磷酸化水平（Fig.2D-E）。以上結(jié)果說明：缺氧條件下HIF-1α增加EGFR表達(dá)，激活 EGFR的下游通路。

三、EGFR基因包含一個(gè)功能性缺氧反應(yīng)元件，也就是HIF-1α與EGFR的結(jié)合位點(diǎn)

前面的結(jié)果已經(jīng)說明HIF-1α能影響EGFR的表達(dá)，為了進(jìn)一步確定HIF-1α是否是EGFR的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作者通過文獻(xiàn)查找EGFR基因中公認(rèn)的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)。從一項(xiàng)研究中使用暴露于0.5% O2或2mM DMOG的MCF-7細(xì)胞中HIF結(jié)合位點(diǎn)的高分辨率全基因組定位發(fā)現(xiàn)：在EGFR基因座的第18內(nèi)含子中存在一個(gè)高強(qiáng)度的HIF -1α結(jié)合區(qū)域（Fig.3A）。同時(shí)用ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了第18內(nèi)含子的結(jié)合區(qū)域，并排除了第17內(nèi)含子區(qū)域（Fig.3B），由于31株乳腺癌細(xì)胞株中只有7株在缺氧條件下顯示出EGFR顯著誘導(dǎo)，作者推測(cè)EGFR可能在HIF-1結(jié)合區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)單核苷酸變異(SNV)，于是作者從10個(gè)細(xì)胞系中分離DNA, Sanger測(cè)序并擴(kuò)增了含有HIF-DNA結(jié)合位點(diǎn)的400 bp的EGFR區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有三株細(xì)胞的有一個(gè)共同的點(diǎn)突變（T >C），采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到，插入的HIF結(jié)合的位點(diǎn)的序列以及包含EGFR的單核苷酸(T >C)突變體，在缺氧條件下熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，而包含有三個(gè)HIF位點(diǎn)突變體對(duì)熒光素酶活性沒有影響（Fig.3C-D）。以上結(jié)果說明缺氧條件下HIF-1α特異性募集到EGFR基因的內(nèi)含子18與EGFR直接結(jié)合，單核苷酸突變未能影響兩者之間的結(jié)合，進(jìn)而無法影響EGFR的表達(dá)。

四、EGFR中的HIF結(jié)合位點(diǎn)改變了乳腺癌細(xì)胞系的甲基化模式

上述結(jié)果說明單個(gè)核苷酸的突變并不能影響乳腺癌細(xì)胞系在缺氧條件下誘導(dǎo)EGFR的表達(dá)情況，考慮到啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是基因沉默的影響因素，作者質(zhì)疑ACGTG結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是否在其中發(fā)揮了作用。

為了評(píng)估EFGR啟動(dòng)子HIF-1α結(jié)合區(qū)的甲基化狀態(tài)，作者提取了MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1、HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231等乳腺癌細(xì)胞的DNA，亞硫酸鹽處理后，PCR擴(kuò)增了約400bp的包含HIF-DNA結(jié)合位點(diǎn)片段，并進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果（Fig.4B）顯示MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1細(xì)胞在HIF-DNA結(jié)合區(qū)未出現(xiàn)易發(fā)生DNA甲基化的位點(diǎn)，而HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231細(xì)胞存在較多的可能發(fā)生DNA甲基化的ACGTG位點(diǎn)。同時(shí)色譜分析亦證實(shí)了上述結(jié)果（補(bǔ)充資料）。接下來作者用甲基化特異性PCR（MS-PCR）和高分辨率熔解曲線分析（HRM）兩種方法驗(yàn)證了