小編看本文的時候有點艱辛吃力，本著學習的態(tài)度，想深入了解作者前期研究。

真是不看不知道，一看嚇一跳~~~

這這這這。 。 。 這算是這位大神的低分之作

我我我我，我竟然都有點耍不明白了！

咱也不BB了，一起來拜讀一下大神的“低分”之作吧。

先看結論！ （如圖）

★ERK 通路的激活使 METTL3 和 WTAP 磷酸化。

★METTL3 的磷酸化增加了與 USP5 的相互作用，減少了泛素化，因此穩(wěn)定m[6]A甲基轉移酶復合物促進m[6]A。

★ERK/METTL3/WTAP 信號軸的激活促進干細胞分化和腫瘤發(fā)生。

通俗演繹就是：

ERK活化后促進腫瘤發(fā)生！

問：為什么會這樣呢？

答：因為多能轉錄本衰變！

問：為什么會衰變呢？

答：因為增加了m[6]A修飾！

問：為什么會增加m[6]A修飾呢？

答：因為甲基轉移酶復合物形成了！

問：為什么會形成呢？

答：因為METTL3/WTAP磷酸化了！

問：問什么會磷酸化呢？

答：因為ERK激活了它們！

問：為什么ERK會激活它們呢？

...再問我打人了??！

要理清楚本文的研究思路，就先要知道（去）磷酸化、（去）泛素化、 m[6]A 這幾個關鍵詞。

咱們生物狗子都知道，中心法則是一切基礎研究的生命之源。

本文的涉及的：

◆ m[6]A 發(fā)生在mRNA轉錄后，決定mRNA的穩(wěn)定、翻譯或降解。

◆（去）磷酸化發(fā)生在蛋白翻譯后，決定蛋白質的活化狀態(tài)。

◆（去）泛素化發(fā)生在蛋白翻譯后，決定蛋白質的降解或存留。

最終行駛生命活動的單位是蛋白質，但在蛋白質前還有基因組的轉錄（主要為表觀調控）、轉錄后的修飾（m[6]A、m[5]C等）、可變剪切（外顯子跳躍、5端或3端內含子保留等導致的各轉錄本的形成）、成熟加工（pri-pre-matur的過程調節(jié)）、再到RNA翻譯為不同的蛋白形式。 但蛋白在不同修飾狀態(tài)下還會有不同的生物學功能，如磷酸化、甲基化乙?；⑻腔?、泛素化、二聚化、多聚化...

等 ...

我們捋一下本文的Result

Fig1. ERK 激活促進 mRNA m[6]A 甲基化

先看個背景知識補充， 方便理解Fig1

2015年有文獻報道含有IRES的circRNAs能夠在真核細胞內編碼蛋白，接著又發(fā)現(xiàn)了不含IRES的陰性對照組circRNAs也能在人類細胞中翻譯！此類不含IRES能夠翻譯的circRNAs有共同的GGACU的序列特征，推斷甲基化驅動翻譯。

☆1A： 為了鑒定m[6]A RNA甲基化的調節(jié)因子，在 HeLa 細胞中使用了包含共有 GGACU 基序 的環(huán)狀RNA GFP報告基因。 GFP 前體 mRNA轉錄物通過反向剪接組裝以生成連接 GFP 的兩個外顯子片段的環(huán)狀 RNA，如圖 1A 所示。 m[6] 環(huán)狀 RNA 上 GGACU 基序的甲基化可以驅動 GFP 轉錄物的翻譯起始，產生 GFP 熒光信號。 因此，來自該環(huán)狀 RNA 報告基因的GFP信號可用作 m[6]A 甲基化的讀數(shù)。

☆1B: 針對19,050 個基因和1,864 個 microRNA (miRNA) 進行了基于 CRISPR 敲除的基因組篩選。 將 CRISPR 敲除文庫與 circRNA m[6]A-GFP 報告基因相結合，可以篩選 m[6]A 甲基化的可能調節(jié)因子。 敲除促進或抑制 m[6]A 甲基化的基因將分別減少或增加 GFP 轉錄本的翻譯。 作者收集了具有 GFP 表達的最多和最低 5% 的細胞，然后進行高通量測序以分別鑒定 m[6]A 甲基化的負調節(jié)因子和正調節(jié)因子。

☆ 1C: 正如預期的那樣，METTL3 的敲除導致屏幕中的 GFP 信號較低。

☆ 1C-D: 低 GFP 表達細胞中 gRNA 的通路富集分析RAS 和 MAPK信號通路的基因 最多。

補充圖中發(fā)現(xiàn)：m[6]A 甲基轉移酶復合物 (METTL3-METTL14-WTAP) 的過表達降低了野生型 RRACT 但不降低突變型 RRTCT 報告基因的表達。為了確定 ERK 如何激活 m[6]A 甲基化，作者首先測試了 ERK 是否與 mRNA m[6]A 甲基轉移酶復合物相互作用。免疫共沉淀表明，在 BRAF 轉染后，METTL3 與 ERK1 和 ERK2 結合（圖 S2A）。

Fig2. ERK 磷酸化 METTL3 和 WTAP

Trametinib ： MEK抑制劑，是一種高特異性的，有效的MEK1/2抑制劑，可激活自噬并誘導凋亡。

A375 細胞 ： 是一種由于 BRAF V600E 突變而具有組成型活性 ERK 的人類黑色素瘤細胞系。

☆ 2A ： 在 A375 細胞中觀察到內源性 ERK2 與 METTL3 和 WTAP 的相互作用，A375 細胞是一種由于 BRAF V600E 突變而具有組成型活性 ERK 的人類黑色素瘤細胞系（圖 2A）。

☆ 2B ： ERK 使用一個共同的 對接域 (CD)與 D 域結合（K/R0–2-X1–6-φ-X- φ) 或綁定到 F 域 (FX-F/YP)。 使用真核線性基序數(shù)據(jù)庫 (http://elm.eu.org) 的分析顯示 METTL3 中的殘基 415-421 和 WTAP 中的殘基 71-77 是潛在的保守 D 域。

☆ 2C: ERK2 的 CD 突變體（321N） 解除了 METTL3 和 WTAP 的相互作用，而 FRS 突變體（263A） 沒有。 免疫共沉淀 (co -IP) 顯示 ERK2 僅與 D 域所在的 myc 標記域結 合（圖 S2D）。 這些結果支持 ERK 與 METTL3 和 WTAP 的交互。

☆ （圖 S2F）進一步驗證了 METTL3 是否是 ERK 的底物。 體外激酶測定表明 ERK 直接磷酸化 METTL3。

☆ 2D-F： 質譜分析表明 ERK 磷酸化METTL3 在三個高度保守的殘基： S43、S50 和 S525。 突變分析進一步證實這三個位點是主要的 ERK 磷酸化位點（圖 2F）。 【圖中 3A 組： 指 METTL3所有三個磷酸化絲氨酸位點都被丙氨酸取代 】

☆ 2G-H ： 為了確定 WTAP 的磷酸化位點，檢測了 S/TP 基序的突變是否影響 ERK 誘導的磷酸化。 在人類 WTAP 的三個 S/TP 基序中，我們發(fā)現(xiàn) S306 和 S341 是人類 WTAP 的主要 ERK 磷酸化位點。

接下來作者探討了 ERK 誘導的磷酸化如何增加 RNA m[6]A 甲基轉移酶復合物的活性。

Fig3. ERK 介導的 METTL3 穩(wěn)定需要 USP5

在分子生物學中放線菌酮可被用來確定蛋白質（酶）的半衰期。 使用放線菌酮處理細胞，然后使用western blot實驗來顯示要被研究的蛋白質隨時間的數(shù)量變化。 由于放線菌酮阻礙蛋白質的合成，細胞內的蛋白質不斷減少。

☆ 3A ： METTL3 在 mESC 和人 A375 細胞中WT組始終比 3A 組更高的表達水平， WTAP也是WT組比2A組始終表達高 。 這一觀察結果提出了一個假設，其中 ERK 使 METTL3 磷酸化穩(wěn)定了蛋白質，這可以解釋更 好的ERK 激活觀察到 METTL3 蛋白水平和 m[6]A 甲基化活性升高。

☆ 在補充圖里研究了 ERK 激活是否會影響 METTL3 穩(wěn)定性，用ERK抑制劑 PD0325901 處理8h，增加了蛋白的泛素化（圖 S3A）。

☆ 3B ： 3A 組的 METTL3的 泛素化水平也高于 WT 組。

☆ 3C： 為了更直接地評估 ERK 對 METTL3 穩(wěn)定性的影響，使用放線菌酮抑制蛋白質合成，并監(jiān)測 METTL3 蛋白質降解情況。 如圖 3C 所示， ERK 激活增加了 WT 的穩(wěn)定性，但沒有增加不可磷酸化的 3A METTL3 ； 與 WT METTL3 相比，磷酸化模擬物 3E METTL3 顯示出穩(wěn)定性的增加。

為了進一步了解 ERK 磷酸化如何降低 METTL3 泛素化，補充圖中發(fā)現(xiàn) USP5 和 USP1的敲低降低了 A375 細胞中的 METTL3（圖 S4B）。市售的 USP1 抑制劑 SJB3-019A 和 USP5 抑制劑 EOAI3402143 (EOAI) 也降低了 METTL3（圖 S4C）?？紤]到 USP5 涉及廣泛的病理過程，并且對 METTL3 的影響最顯著，選擇進一步研究它。

☆ 3D ： 隨后研究了在活化的 BRAF 存在下 METTL3 的磷酸化是否會影響 METTL3-USP5 相互作用。 作者注意到 ERK 激活增加了 METTL3 和 USP5 之間的相互作用，這種相互作用隨著磷酸缺陷突變體 S43A、S50A、S525A 變弱，并在所有三個位點都發(fā)生突變時完全減弱。 3E METTL3 與 USP5 的結合更強。 BRAF 表達也進一步促進了 3E METTL3-USP5 相互作用并增加了其表達。 這表明 BRAF 也可能影響 USP5 活性。

因為 USP5 是一種可以阻止蛋白質泛素化的酶，進一步驗證了 USP5 是否通過去泛素化穩(wěn)定 METTL3。

☆ 3E ： WT 組（過表達 USP5 ）比 C335A 組（過表達突變的 USP5 ）降低了泛素化并穩(wěn)定了 METTL3。

☆ 3F： 找到 抑制 USP5 而誘導 METTL3 的降解的泛素連接酶， 作者搜索了共識基序和物理關聯(lián)數(shù)據(jù)庫以及基于 CRISPR 的基因組篩選。 METTL3 包含 SPOP 結合共識基序和 COP1 結合破壞基序 (http://elm.eu.org)。 它還與 TRIM28、HUWE1 和 UBR5 (https://thebiogrid.org) 相互作用，并且可能被 SMURF1 (
http://ubibrowser.ncpsb.org) 泛素化。從 CRISPR 篩選中鑒定出 FBXW8、FBXW12、SPOPL、TRIM2 和 ANAPC1 作為 m[6]A 甲基化的負調節(jié)因子。 為了找到參與 METTL3 降解的泛素連接酶，用靶向泛素連接酶的小干擾 RNA (siRNA) 進一步轉染 USP5 敲低的 A375 細胞。 敲除 SPOP、TRIM28 或 ANAPC1 部分消除了 USP5 抑制介導的 METTL3 降解。

總之，這些結果表明 USP5 通過去泛素化穩(wěn)定 METTL3

Fig4. ERK 對 METTL3/WTAP 的磷酸化促進 細胞分化

mESC： 小鼠胚胎干細胞

據(jù)報道，自分泌 FGF4 是 mESC 中 ERK 信號傳導的主要刺激物。FGFR 或 ERK 活性的干擾阻礙了 mESCs 進行分化和保留多能性因子（包括 Nanog）表達的能力。

作者觀察到 p-43 METTL3 磷酸化被 FGF4 增強并被 MEK 抑制劑 PD0325901 或 FGFR1 抑制劑 PD173074 降低（圖 S5A）。 因為據(jù)報道， mESCs 在分化時退出多能狀態(tài)需要 ERK 激活和 METTL3 表達， 因此作者進一步研究了 METTL3/WTAP 的磷酸化是否影響 mESC 命運 。

☆ 4A ： 將 TetOn-shWTAP 引入 METTL3 敲除 (KO) 的 mESC 以調整內源性 WTAP 表達。 然后用 WT 或磷酸失活突變體 CuO-METTL3-T2A-WTAP 轉 染細胞。 通過液相色譜-串聯(lián)質譜（ LC-MS/MS ） 對 m[6]A 的定量顯示出 3A METTL3 和 2A WTAP 的協(xié)同減少。

☆ 4B ： R-3A2A mESCs 表現(xiàn)出更高的增殖增加和階段特異性胚胎抗原 1 (SSEA-1) 表達（圖 S5C）。 這些觀察結果支持 METTL3 和 WTAP 磷酸化的喪失將 mESC 維持在多能狀態(tài)的觀點。

☆ 4C ： m[6]A 甲基化多能性因子轉錄本，包括 Nanog、Zfp42、Klf2、Sox2 和 Lefty1。 不含任何 m[6]A 修飾的 Pou5f1 也用作陰性對照。 m[6]A-RIP-qPCR 證實 m[6]A 減少，qRT-PCR 表明這些 m[6]A 標記的多能性轉錄本在 R-3A2A mESC 中上調（圖 4D）。

☆ 4E ： R-3A2A mESCs 未能抑制多能基因，并充分上調發(fā)育標記 物的指標。

這些結果支持 METTL3 和 WTAP 的 ERK 依賴性磷酸化促進 mESC 分化的觀點。

Fig5-6. 受 mESC 中甲基轉移酶復合物磷酸化影響的轉錄本

為了進一步了解 m[6]A 甲基轉移酶復合物的磷酸化如何影響 m[6]A 修飾的轉錄本，作者繪制了 mESC 中的 m[6]A 甲基化組。

☆5A ： R-WT 與 R-3A2A mESC 的比較揭示了甲基化位點的整體丟失。

☆ 5B-C： 使用作者內部 R 包“MeRIPtools”： 它使用基于二項分布的模型測試 m[6]A IP 富集； 發(fā)現(xiàn) 7,591 m[6]A 峰顯示 R-3A2A 細胞顯著減少與 R-WT 細胞相比，例如 Nanog、Lefty1 和 Zfp219 中的修飾位點（圖 5C）。

☆ 5D-F： GO分析， m[6]A 甲基化降低（圖 5D）和差異表達（圖 5E）的轉錄本富集了與多能性和 mRNA 加工相關的基因。 重要的是，與 R-WT mESCs 相比， 許多參與多能性的基因在 R-3A2A 細胞中顯示出降低的 m[6]A 甲基化 （圖 5F）。

☆ 6A-B ： 正如預期的那樣，m[6]A 甲基轉移酶復合物在 R-3A2A A375 細胞中的穩(wěn)定性降低，這導致 mRNA 的整體 m[6]A 水平較低（圖6B）。

☆ 6C-D： 發(fā)現(xiàn) MEK 抑制劑 PD0325901 和Trametinib 可減少蛋白質A375 黑色素瘤細胞中 m[6]A 甲基轉移酶復合物的水平 （圖 6C） 和整體 mRNA m[6]A 水平 （圖 6D）。

☆ 6E ： 使用兩種結構無關的 USP5 抑制劑 EOAI 和 vialinin 來評估 USP5 對黑色素瘤中 METTL3 水平的影響細胞。 發(fā)現(xiàn)這兩種 USP5 抑制劑增加了 METTL3 的泛素化，導致 METTL3 蛋白水平降低 （圖 6E、S7E 和 S7F）。

☆ 6F ： MEK 抑制 劑， R-3A2A 或 METTL3-WTAP 敲低可使黑色素瘤和結腸癌細胞對 USP5 抑制敏感（圖 6F 和 S7G），支持 USP5 和 METTL3 之間的聯(lián)系。

最后，考慮到 HER2 表達使 METTL3 和 WTAP 磷酸化（圖 S1C 和 S7H），并且過表達 HER2 的 SKBR3 和 BT474 細胞中的 m[6]A 水平更高（圖 S7I），研究了抑制 HER2 是否會影響 m[6] ]甲基化。

☆ 6G-H： 兩種 HER2 抑制劑，tucatinib 和 lapatinib，可以降低 HER2 陽性乳腺癌中 METTL3 蛋白水平和 mRNA m[6]A 甲基化（圖 6G 和 6H）。

總體而言，這些數(shù)據(jù) 支持 ERK 依賴性 METTL3 穩(wěn)定性影響細胞 mRNA m[6]A 甲基化，這可能有助于腫瘤發(fā)生。

好了文章就到這里了，

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