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  亞硫酸氫鈉測序（BSP）實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物分享，亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則不變。通過設(shè)計(jì)針對甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，將符合預(yù)期的產(chǎn)物純化回收連接T載體，進(jìn)行陽性克隆測序即可獲取某個特定基因區(qū)段內(nèi)每個CpG位點(diǎn)的甲基化程度。普拉特澤生物表達(dá)檢測平臺長期為廣大科研人員提供亞硫酸氫鈉測序外包服務(wù)，本文咱們就一起來看看BSP實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟吧~

  1、引物設(shè)計(jì)

  在GenBank上找到待檢基因啟動子區(qū)的原始序列，輸入到“MethPrimer”軟件中，輸入啟動子序列，選擇“Pick primers for bisulfite sequencing PCR?or restriction PCR?”，其他參數(shù)選擇程序默認(rèn)值，點(diǎn)擊“Submit”，“MethPrimer”軟件即可顯示預(yù)測的啟動子序列的CpG島，及引物的相應(yīng)位置，同時(shí)也顯示設(shè)計(jì)的BSP引物。選擇多對引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定引物序列。

      2、基因組提取

  使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（實(shí)驗(yàn)步驟見PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分別提取各樣本基因組。提供的細(xì)胞量要求大于10^6個。提取濃度在100-400 ng/μL之間，OD 260/280均在1.8-2.0之間，提取質(zhì)量合格。

       3、亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

  （1）將提取獲得的基因組DNA 3 μg以無菌雙蒸水稀釋至50μl，然后加入NaOH （終濃度為0.2 M）在42℃水浴變性30 min。

  （2）依次加入30μl 10mM對苯二酚（氫醌）、520μl 3 M亞硫酸氫鈉（pH=5.0要求精準(zhǔn)）至上述水浴后混合液中，輕柔顛倒混勻。

  （3）加入200μl石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；50℃避光水浴16h。

  4、修飾后DNA純化回收

  修飾后的DNA使用純化試劑盒進(jìn)行過柱純化，回收后用50μl無菌雙蒸水溶解，并測定濃度。

  5、PCR擴(kuò)增

       PCR引物設(shè)計(jì)、退火溫度選擇、Taq酶及Buffer的選擇都會影響擴(kuò)增的成敗，需要不斷優(yōu)化。

     6、擴(kuò)增產(chǎn)物回收

     將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，進(jìn)行膠回收，步驟如下：在紫外燈下，切下包含目的片段的膠條。用天平稱量總重量并減去空管的重量算出凝膠的重量，按100mg=100μL來計(jì)算凝膠的體積，并加入1倍凝膠體積的Binging Solution置于65℃水浴鍋內(nèi)將凝膠徹底融化。期間適當(dāng)搖晃EP管，加快凝膠的溶解。

  將上述液體全部轉(zhuǎn)移到濾柱內(nèi)，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復(fù)一次）。然后棄掉管內(nèi)液體，向柱內(nèi)加入500μL的WA Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S。棄掉管內(nèi)液體，再向柱內(nèi)加入500μL的Wash Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復(fù)一次）。然后空離3 min。將濾柱放置在一個新的1.5mL EP管中，室溫晾干。最后在柱子內(nèi)加入35 μL的ddH2O，靜置5min，13000轉(zhuǎn)離心90s。為了提高回收率，可將溶解的DNA再次加入柱子內(nèi)離心一分鐘。棄掉柱子，回收的即為擴(kuò)增產(chǎn)物片段，并測定濃度。

  7、進(jìn)行重組反應(yīng)

  將回收的擴(kuò)增片段與T克隆載體進(jìn)行重組，完成回收目的基因與載體的重組過程。

      8、轉(zhuǎn)化

  （1）將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上（4℃）待其自然解凍后，取10 μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上（4℃）放置30 min。

  （2）之后于42℃水浴中熱擊90 S，然后迅速置于冰上（4℃）放置2-3 min。

  （3）加入500μL不含抗生素的SOC培養(yǎng)基于37℃,225rpm振蕩培養(yǎng)45 min。

  （4）3000轉(zhuǎn)離心2 min，棄掉900μL的上清液，將管底的菌液吹打散開，加入到含有載體上對應(yīng)抗性（氨芐或卡那等）的培養(yǎng)平板中，用滅菌的涂布器涂勻（涂布器的溫度不能太高，以免燙死菌體），倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。

  9、克隆鑒定

  挑起平板多個克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，陽性克隆子再進(jìn)行測序鑒定，保證最終拿到5個有效樣品測序數(shù)據(jù)。

  好啦，那關(guān)于亞硫酸氫鈉測序BSP測序的詳細(xì)操作步驟咱們就講到這里啦，是不是很細(xì)節(jié)呢？如果您還有什么實(shí)驗(yàn)問題或有BSP檢測外包的需求歡迎隨時(shí)咨詢哦~