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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

EdU檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染處理對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。

二、實(shí)驗(yàn)樣品

2.1 實(shí)驗(yàn)樣本

備注：包括干預(yù)細(xì)胞用的相關(guān)試劑均按實(shí)驗(yàn)樣品登記，每行登記一個(gè)或一組獨(dú)立樣品。

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

                     圖1：EdU熒光檢測(cè)示例圖

                                              圖2：熒光定量分析柱狀圖



四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

  如圖所示，在CAL27細(xì)胞中，mimics NC和miR-23b-3p mimics組間無明顯差異，與inhibitorNC組相比，miR-23b-3p inhibitor組細(xì)胞增殖能力有所上調(diào)；SCC25細(xì)胞各組間無明顯差異。

請(qǐng)注意：因無法獲知研究背景及研究方案，我司提交的結(jié)果說明僅針對(duì)該次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行客觀描述，所下結(jié)論僅供參考。請(qǐng)合理判斷該檢測(cè)結(jié)果的可用性。

五、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 細(xì)胞復(fù)蘇 （如有）

(1)將ddH2O預(yù)溫至37℃。

(2)戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3)完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺(tái)。

(4)在超凈臺(tái)中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5)1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6)48小時(shí)后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。

3.2 細(xì)胞鋪板及轉(zhuǎn)染 （如有）

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算后，按照密度為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，種到24孔板中，鋪細(xì)胞18-24 h (盡量不要超過24小時(shí)，否則影響轉(zhuǎn)染效率)，細(xì)胞長(zhǎng)至70～90%轉(zhuǎn)染（細(xì)胞密度過稀或者過密均會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率），以24孔板為例：

(1) 將 1.6 μL LipoFiter /2 μL Lipo2000加入50 μLopti-mem Medium中,變成預(yù)混液1，室溫放置5 min。

(2) 將0.8 μg質(zhì)粒/20 pmol目的片段加入到50 μL opti-mem Medium中混合，變成預(yù)混液2。

(3) 將質(zhì)粒和 LipoFiter/Lipo2000混合（預(yù)混液1和預(yù)混液2進(jìn)行混合），室溫放置20分鐘。

(4) 將24孔板里的完全培養(yǎng)基換成150 μL opti-mem Medium。

(5) 將轉(zhuǎn)染混合液緩慢加入到24孔板，輕輕前后晃動(dòng)混勻。

(6) 37℃，5% CO2培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。

3.3 EdU檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟

EdU 標(biāo)記：

（1）用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按比例稀釋EdU溶液，制備適量2×EdU 工作液，終濃度為50μM； 

（2）每孔加入37°水浴的 EdU 工作液液500μL和500μL培養(yǎng)基（1比1），混合均勻后于培養(yǎng)箱孵育6-7小時(shí)（可根據(jù)細(xì)胞增殖速度，適當(dāng)調(diào)整孵育時(shí)間），使EdU終濃度為50 μM ； 

（3）棄孵育培養(yǎng)基，PBS（含3%BSA，以下PBS表示）清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。 

細(xì)胞固定及通透：

（1）每孔加入1 mL細(xì)胞固定液 (即含4%多聚甲醛的 PBS)室溫孵育15分鐘，棄固定液；  

（2）每孔加入PBS，清洗3次，每次5分鐘；

（3）每孔加入1 mL滲透劑(0.3% TritonX-100的PBS)室溫孵育15分鐘；PBS清洗3次，每次5分鐘

EdU檢測(cè)：

（1）每孔加入0.2 ml Click反應(yīng)混合液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品，體系按需配置；避光反應(yīng)1-2小時(shí)；

（2）吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘；  

DNA 染色：

（1） DAPI溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋DAPI (1000X），避光保存； 

（2） 每孔加1X DAPI溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘左右；

（3）每孔加入PBS 清洗 1~3 次；

（4）采圖。

五、熒光定量分析數(shù)據(jù)



注：組化定量分析采用image pro plus 6.0軟件，IOD值為圖片上各點(diǎn)光密度值的累加，此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比；IOD值除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到平均density,此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。對(duì)樣品照片進(jìn)行數(shù)字圖像分析比較時(shí)，就是比較他們之間的平均光密度值的大小。

單位為a.u.(arbitrary unit)，是無量綱單位

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