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        PCR檢測支原體操作步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，PCR檢測是支原體檢測中最常用的實驗方法，其他分別是化學(xué)發(fā)光法、DNA染色法、支原體培養(yǎng)法等。普拉特澤生物表達(dá)檢測平臺長期為廣大基礎(chǔ)科研人員提供支原體檢測外包服務(wù)，歡迎咨詢。

       支原體因為個頭小，能穿過0.22 μm濾器，并且在實驗室內(nèi)會潛在的擴(kuò)散。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液不一定會發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。所以支原體感染會使培養(yǎng)的細(xì)胞慢慢枯萎，使得用被污染的細(xì)胞樣本做的實驗完全失去
意義和價值。因此，有必要對新引進(jìn)的細(xì)胞和實驗過程中的細(xì)胞株進(jìn)行支原體檢測。

        PCR法檢測的實驗原理是：原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區(qū)的DNA 序列及長度在Mycoplasma 各個種間既有相對保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼16S 和23S rRNA的DNA 上設(shè)計一對F1/R1 引物，擴(kuò)增編碼16 S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴(kuò)增 Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。

        PCR法檢測支原體操作步驟
 
  如下：

        1、支原體樣品預(yù)處理

        收集200 ul樣品于PCR管中，12000rpm離心5分鐘，去除上清液，加入30 ul純水或者PBS重懸，然后將其置于95℃加熱10分鐘，冷卻到12℃，最后8000rpm離心2分鐘，上清液為樣品備用。

        2、支原引物檢測

        3、PCR檢測

        （1）將合成的引物稀釋成終濃度為100 nmol/L的儲藏液與10 nmol/L的工作液。

        （2）配制PCR預(yù)混液。

        （3）向以上反應(yīng)混合液中加入檢測樣品（5ul以下），使總體積達(dá)到50ul。添加樣本時應(yīng)防止交叉污染。

        （4）把反應(yīng)管放入PCR儀中，設(shè)定以下條件，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR的檢測下限是M. capricolum 1ng， M. hyopneumoniae和U. urealyticum 100pg、其他的Mycoplasma是10pg。但是Human DNA、Mouse DNA在100 ng時有非特異性片段擴(kuò)增。

        （5）預(yù)先配置好1~1.5%的瓊脂糖膠，將完成的PCR反應(yīng)液依次加入到膠孔中并選擇合適的Marker進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

        4、實驗注意事項

        （1） PCR反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行。

        （2）檢測前，待測細(xì)胞要用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d。

        PCR法檢測支原體因為操作簡單、準(zhǔn)確率高成為大家檢測支原體最常用的方法，那PCR檢測支原體的步驟和注意事項就給大家介紹到這里啦，如果您還有什么其他的技術(shù)問題或支原體檢測外包的需求歡迎直接留言給客服，技術(shù)會第一時間回復(fù)您的哦~