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        大家好，今天普拉特澤生物繼續(xù)給大家介紹一個新的實驗——支原體檢測實驗。支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，極易感染實驗室中的實驗細胞，相信每一個親手養(yǎng)過細胞的實驗員都對這種又小又無處不在的原核生物深惡痛絕，一個不小心，培養(yǎng)基細胞團滅還摸不出原因。普拉特澤表達檢測平臺為廣大科研服務(wù)人員提供專業(yè)的支原體檢測外包服務(wù)，歡迎咨詢。

        那現(xiàn)在我們先來看看，什么是支原體吧~

        支原體（mycoplasma）是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細胞型微生物，大小為0.1～0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。支原體廣泛存在于人和動物體內(nèi)，大多對動物不致病，但是對人致病的支原體。

        支原體的革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原體主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成絲狀后斷裂呈球桿狀顆粒。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長溫度為35℃，最適pH值為7.8～8.0。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成典型的“荷包蛋”狀菌落。支原體抵抗力較弱，對熱、干燥敏感，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，對紅霉素、四環(huán)素、螺旋霉素、鏈霉素、卡那霉素等藥物敏感，但對青霉素類的抗生素不敏感。臨床上支原體致病性較弱，一般不侵入血液，但可通過黏附作用與宿主細胞結(jié)合，從細胞膜獲取脂質(zhì)，使細胞膜損傷。溶脲脲原體可分解尿素放出大量的氨，對細胞有毒害。

        細胞培養(yǎng)過程中，由于實驗環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。同時，由于支原體直徑很小，僅在0.1～0.3微米之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實驗者肉眼發(fā)覺。而支原體污染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，被支原體污染的細胞會持續(xù)受到影響，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

        支原體檢測試驗的原理是根據(jù)特定序列設(shè)計引物PCR擴增后用瓊脂糖電泳檢測是否能跑出條帶：

        原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區(qū)的DNA序列及長度在Mycoplasma 各個種間既有相對保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼16S 和23SrRNA的DNA 上設(shè)計一對F1/R1 引物，擴增編碼16S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴增Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。

        通過對支原體特定的序列設(shè)計引物，當(dāng)存在支原體污染時通過PCR特異性擴增，會將目標(biāo)DNA特異性地復(fù)制，然后通過瓊脂糖電泳檢測，會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果。反之當(dāng)沒有支原體污染時，由于沒有模板，PCR無法擴增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果。

        同時在取細胞樣本進行支原體檢測時要注意：

        1、取待檢樣本：

        一般是接種后進行 3-6d細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液；

        如果使用 Eagle 等常用的細胞培養(yǎng)基時，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應(yīng)液中；

        如果使用細胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進行 PCR 反應(yīng)。    

        2、一定要設(shè)置陽性對照（一般采用帶有支原體特異片段的質(zhì)粒）與陰性對照（H2O）；

        3、配制PCR反應(yīng)體系時需在超凈工作臺里進行，避免污染。

        希望大家在培養(yǎng)細胞時永遠不會在自己的培養(yǎng)基檢測到支原體這種小小的原核生物，如果您正好有細胞需要進行支原體檢測外包的話普拉特澤生物義不容辭！后兩期支原體檢測的詳細操作步驟與細胞被支原體污染后的處理方法~下期見~