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Question：實(shí)驗(yàn)中如何使用過表達(dá)（普拉特澤生物提供長期穩(wěn)定的分子、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)）

   答：一．常用基因操作方法包括：基因過表達(dá)，RNAi,CRISPR/CAS9
二．基因功能的基本研究方式

1. 對目的基因的操作：

表達(dá)上調(diào)，表達(dá)下調(diào)，使用激動劑；抑制劑；基因突變；

表達(dá)從無到有，從有到無；從低到高；從高到低等

2. 對目的基因進(jìn)行操作后對功能（表型）進(jìn)行檢測：

生長、凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞周期、血管新生、增值、遷移等等

3. 傳統(tǒng)研究基因功能的方式

A.將基因轉(zhuǎn)入到目的細(xì)胞中使得基因的表達(dá)量上調(diào)，再看細(xì)胞的功能表型

實(shí)驗(yàn)方法是將目的基因的CDS區(qū)也就是編碼區(qū)構(gòu)建到載體上，再將這個載體導(dǎo)入到目的細(xì)胞中，能夠使得目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)量上升

B.RNAi

RNAi：是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象。可以通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA（有義RNA和反義RNA），從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。（在細(xì)胞內(nèi)本底表達(dá)非常低的基因不適用）

C.CRISPR-CAS9

前幾期草莓分享過客關(guān)于CRISPR-CAS9的技術(shù)原理，感興趣的可以往前幾期看看

CRISPR-CAS9與RNAi的對比：

RNAi和CRISPR-Cas9在作用水平、靶位點(diǎn)范圍、靶蛋白消除水平以及靶蛋白功能等方面存在顯著差異。選擇哪種技術(shù)取決于具體的研究目的和實(shí)驗(yàn)需求。

D.使用CRISPR-CRISPRa系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)

在CRISPRa技術(shù)中，使用的是dCas9蛋白，這是一種經(jīng)過改造的Cas9蛋白，其核酸酶活性被失活，因此無法切割DNA。然而，dCas9蛋白仍然能夠保留其DNA結(jié)合能力，即能夠特異性地識別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。為了實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄激活，dCas9蛋白被進(jìn)一步改造，與特定轉(zhuǎn)錄激活因子(VP64,MS2等)相融合。當(dāng)我們把gRNA的設(shè)計(jì)在某個基因的啟動子上，那么這些轉(zhuǎn)錄因子就一股腦的到了這個啟動子附近，這些轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有上調(diào)啟動子的活性，增加轉(zhuǎn)錄

CRISPRa與傳統(tǒng)基因過表達(dá)方法的對比

CRISPRa的優(yōu)點(diǎn)：

高特異性：CRISPRa利用dCas9與sgRNA的特異性結(jié)合，能夠精確地激活目標(biāo)基因

調(diào)控細(xì)致：該技術(shù)能夠在基因的自然位點(diǎn)上調(diào)控表達(dá)，避免了傳統(tǒng)過表達(dá)方法中可能出現(xiàn)的非生理水平的表達(dá)，使得調(diào)控更為細(xì)致和準(zhǔn)確。

不改變基因組背景：CRISPRa技術(shù)不直接改變內(nèi)源基因組序列，僅通過轉(zhuǎn)錄激活來上調(diào)基因表達(dá)，減少了潛在的安全風(fēng)險。

多基因調(diào)控能力：通過設(shè)計(jì)多條sgRNA，CRISPRa可以同時激活多個靶基因，為復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的研究提供了有力工具。

CRISPRa的缺點(diǎn)：

激活效率不完全：盡管CRISPRa具有較高的特異性，但激活效率可能不完全，有時無法達(dá)到預(yù)期的基因表達(dá)水平。

脫靶效應(yīng)風(fēng)險：雖然CRISPRa的特異性較高，但仍存在脫靶效應(yīng)的風(fēng)險，即可能錯誤地激活非目標(biāo)基因的表達(dá)。

傳統(tǒng)基因過表達(dá)方法的優(yōu)點(diǎn)：

實(shí)驗(yàn)操作簡單：傳統(tǒng)基因過表達(dá)方法的實(shí)驗(yàn)步驟相對簡單，通常只需構(gòu)建包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒并導(dǎo)入細(xì)胞即可。

激活效率高：由于直接導(dǎo)入外源基因，傳統(tǒng)過表達(dá)方法通常具有較高的激活效率，能夠迅速提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。

傳統(tǒng)基因過表達(dá)方法的缺點(diǎn)：

調(diào)控不細(xì)致：傳統(tǒng)過表達(dá)方法往往難以模擬生理?xiàng)l件下的基因表達(dá)模式，調(diào)控細(xì)致度較低。

擴(kuò)增CDS可能受限于序列

可能產(chǎn)生免疫反應(yīng)
冰凍三尺，非一日之寒，普拉特澤致力于幫助廣大科研工作者解決科研實(shí)驗(yàn)中的各方面問題，不但授人以魚，亦授人以漁。