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        Th細(xì)胞亞群檢測步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享。上期小編給大家介紹了淋巴細(xì)胞亞群檢測的原理與臨床意義，忘記可以回去復(fù)習(xí)。本期小編為大家分享的是以T細(xì)胞亞群為例的淋巴細(xì)胞檢測實驗步驟與方法，普拉特澤生物流式檢測平臺承接流式檢測實驗服務(wù)上百例，長期提供穩(wěn)定專業(yè)的淋巴細(xì)胞亞群檢測外包服務(wù)，歡迎咨詢。

        細(xì)胞亞群的檢測方法種類繁多，大多都是根據(jù)細(xì)胞表面抗原及其抗體的特異性反應(yīng)設(shè)計的。隨著單克隆抗體的問世及各種檢測方法的建立，淋巴細(xì)胞亞群檢測已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。目前，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）為淋巴細(xì)胞亞群檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。

        那么現(xiàn)在跟小編一起來看看，以人血和小鼠Th細(xì)胞亞群為例檢測的操作步驟吧~

        1、外周血單個核細(xì)胞的分離:取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5mL。在試管內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液3mL將外周血以等體積Hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液上層。2000g離心20 min。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個核細(xì)胞,加入Hanks液3mL混勻后，1500g離心5 min。棄去上清，細(xì)胞加入0.5mLRIMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清，50ug/mlpenicillin和50ug/mlsteptomycin)重懸，血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。

        2、不同濃度的HMA刺激后人T淋巴細(xì)胞CD4D8和CD3的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5x10⁵個細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基至總體積1mL。加入不同濃度的HMA(10ng、20ng和50ng終濃度)和500ngmlIonomycin共同刺激人外周血單個核細(xì)胞同時加入0.7uLGolgistop37℃O孵箱刺激4h。收集單個核細(xì)胞分為三部分，分別加入CD8-CYC CD4-CYC CD3-APC單抗各10uL，室溫避光孵育30 min。加入紅細(xì)胞裂解液(FACSLysingSolution)lml裂解殘余紅細(xì)胞，2m1PBS洗滌細(xì)胞一次。流式細(xì)胞儀(FACSCaliburBectonDickinson)檢測細(xì)胞,Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞，每個檢測獲取10000個細(xì)胞。采用前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以直方圖分別表示CD3、D8和D4陽性淋巴細(xì)胞。

        3、不同時間HMA和離子霉素刺激后小鼠T淋巴細(xì)胞CD4和D的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5x105個細(xì)胞，加入RHMI1640培養(yǎng)基至總體積1mL。加入HMA和Ionomycin使終濃度分別為100ng/ml和1ug/ml，同時加入0.7μLGolgistop。37度二氧化碳孵箱刺激8h 12h分別收集細(xì)胞。采用抗小鼠CD4-CYCCD8PE抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD4和CD8的表達(dá)。

        4、流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血Th1和Th2細(xì)胞。分離外周血單個核細(xì)胞，加入20ng/mlPMA和500ng/ml離子霉素刺激4h后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，分別加入CD3-APCCD8-PercP10uL，混勻，室溫放置20 min，加入紅細(xì)胞裂解液lmL混勻，室溫放置10 min，1000g離心5 min，棄上清。加入Cytofix/Cytopemm液200μL，4℃放置20 min，使細(xì)胞固定穿孔。加入PemWash液lmL1500g離心5 min，棄上清。實驗管加入IFN-V-FITCIL-4-PE各5ul，對照管加入同型對照抗體，4℃避光孵育30 min。加入PemWash液500μL洗滌兩次。最后以300ul洗滌液重懸細(xì)胞。采用FACScom軟件及CD3-APCCD8-PercP、IFN-V-FITC、IL-4-PE抗體單雙標(biāo)記的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以D3和D8散點圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞(D3+D8)。最終以IFN-y和IL-4的散點圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。

        5、流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血Th1和Th2細(xì)胞。分離外周血單個核細(xì)胞，加入100ng/mlPMA和1ug/ml離子霉素刺激5h后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，加入CD4-CYC10ul，混勻，其余步驟同人的檢測。調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞(D4)，以IFN-v和IL-4的散點圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。

        那Th淋巴細(xì)胞亞群檢測步驟就講完啦，如果您還有其他的檢測方法或有淋巴細(xì)胞亞群檢測外包的需求歡迎隨時留言~咱們下個實驗見！