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WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹【新手入門】

2020-12-11 14:59:38

來(lái)源/作者:普拉特澤生物-醫(yī)學(xué)整體課題外包

到九月了哦~嬌小可愛的萌新師妹來(lái)了哦,有木有很開心呀??!

那么問(wèn)題就來(lái)了:論如何在師妹面前裝一手好Bility呢?不想裝Bility的科研狗可不是正經(jīng)科研狗,裝不了Bility的科研狗更是沒能力的科研狗!

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正所謂:愛也WB(順利一跑就跑出來(lái)了),恨也WB(不順利作死的也跑不出)。作為科研工作的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù),曉其原理、知其操作、懂其分析,并能做出一塊“內(nèi)參條帶均勻平整,目的條帶錯(cuò)落有序”的好膜,必將助你在裝Bility路上獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷!


下面就簡(jiǎn)單介紹下WB實(shí)驗(yàn)技術(shù):


1. Western blot是干啥的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是①檢測(cè)蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定蛋白質(zhì)的存在與否(定性);②確定同一蛋白質(zhì)在不同樣本中的多與少(半定量)。


2. 內(nèi)參蛋白是啥玩意。內(nèi)參就是內(nèi)部參照,對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白,它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定。比如常用的內(nèi)參β-actin即肌動(dòng)蛋白,是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。依據(jù)不同的目的蛋白選擇合適的內(nèi)參。


3. BCA法是個(gè)啥。堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子,BCA與一價(jià)銅離子結(jié)合形成紫藍(lán)色絡(luò)合物,在562nm處有最大吸光值且與蛋白濃度成正比。(個(gè)人覺得可以順帶給師妹講一下ELISA酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng))


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4. 電泳之PAGE的濃縮效應(yīng)與分子篩作用。①電泳開始階段,由于不連續(xù)pH梯度而將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶,提高分離效果;②PAGE具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),能起分子篩作用。


5. 蛋白變性之SDS。影響電泳的3因素:蛋白質(zhì)的大小、形狀及所帶電荷。①SDS結(jié)合蛋白質(zhì)后再加熱,能把折疊的蛋白質(zhì)打開,排除形狀的影響;②SDS帶強(qiáng)負(fù)電荷,結(jié)合蛋白質(zhì)后使其原有電荷微不足道,排除所帶電荷的影響。SO,電泳結(jié)果只跟蛋白質(zhì)分子量有關(guān)


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6. 十萬(wàn)個(gè)為什么之封水。封水目的是是分離膠表面平直并排除氣泡,so,均勻且勻速,可以輕微晃蕩(輕微啊!晃不好別怪我!)。膠水之間形成清晰界面是凝膠聚好的標(biāo)志。


7. 十萬(wàn)個(gè)為什么之上樣量一致。這個(gè)就不用多講了吧。上樣量不一致蛋白質(zhì)含量不一致,最后的條帶結(jié)果有什么意義呢?


8. 轉(zhuǎn)膜的故事。這個(gè)也比較簡(jiǎn)單,手輕點(diǎn)不要弄破了、不要有氣泡、膜的大小適合(PVDF膜還是有點(diǎn)小貴的,年輕人不要浪費(fèi)?。?。最好做個(gè)標(biāo)記(我會(huì)在一個(gè)角剪一丟丟),標(biāo)記正反面哦!


9. 封閉與抗體孵育的故事。一抗特異性結(jié)合蛋白質(zhì),標(biāo)記有HRP(跟顯色底物反應(yīng))的二抗特異性的結(jié)合一抗,易于檢測(cè)。封閉就是為了防止抗體與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生高背景。我一般一抗用一次,二抗回收(最多用三次)。脫脂牛奶容易發(fā)臭的!用不完及時(shí)丟!

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一點(diǎn)小建議

①請(qǐng)做一塊好膠!膠的影響挺大的。玻璃板洗干凈一點(diǎn)!

②預(yù)實(shí)驗(yàn)一定要做!怎么也得有三個(gè)抗體梯度吧。不然一頓操作猛如虎,條帶結(jié)果一團(tuán)糊。

③請(qǐng)做好個(gè)人防護(hù),制膠材料有很多神經(jīng)毒素的!

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