大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)——細(xì)胞自噬大盤點 

一 什么是細(xì)胞自噬
細(xì)胞自噬（Autophagy）是指細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器在自噬相關(guān)基因 (Autophagy associated gene，Atg)的調(diào)控下被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，溶酶體對其消化降解的過程。正常的動物細(xì)胞為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡，需要不斷降解功能失常或不需要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通常壽命較短的蛋白質(zhì)通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解，而壽命較長的蛋白質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)則通過自噬途徑由溶酶體降解。
二 細(xì)胞自噬的特征
目前的自噬可分為三類，包括巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA），其中巨自噬是最主要，也是研究得最多的形式。細(xì)胞自噬的過程主要包括隔離膜（Phagophore）的形成、擴(kuò)展、自噬體（Autophagosome）的形成、自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體（Autophagolysosome）。自噬溶酶體形成后，內(nèi)含物被溶酶體中的水解酶消化。

圖1.哺乳動物的三種自噬類型

三 細(xì)胞自噬的過程
細(xì)胞自噬的過程不是一個完全被動的細(xì)胞學(xué)過程，而是細(xì)胞自身在受到外界的刺激通過一系列的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)的一系列細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種主動的生物學(xué)過程。完整的自噬發(fā)生過程大體分為以下4個階段：自噬的起始→隔離膜和自噬體的形成→自噬體與溶酶體融合→自噬體的裂解。

                                                                                                   圖2. 細(xì)胞自噬的過程（Li et al. Molecular Cancer, 2020）
四 常見細(xì)胞自噬的檢測方法
檢測自噬水平的方法主要有三種：電鏡觀察、Western Blot檢測和熒光蛋白標(biāo)記檢測。

1.電鏡觀察

透射電子顯微鏡檢測自噬基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)，是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。

圖3. 透射電鏡下自噬體（單箭頭）和自噬溶酶體（雙箭頭）形態(tài)

2.Western Blot

1）自噬過程中，LC3在合成后其C端被切割變成LC3-Ⅰ，散在分布于胞漿內(nèi)；當(dāng)自噬體形成LC3-Ⅰ后，與磷脂酰乙\醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并且始終穩(wěn)定保留，直到與溶酶體融合。因此可利用WB檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的變化以評估自噬的強(qiáng)弱。

2）p62作為自噬的重要受體，主要依賴于自噬途徑進(jìn)行降解。因此，p62的蛋白水平也常常用來指示自噬的降解情況。

圖4. WB檢測LC3、p62蛋白的表達(dá)

3.熒光蛋白標(biāo)記

1）GFP-LC3

無自噬時，GFP-LC3在胞漿中彌散分布；自噬形成時，GFP-LC3聚集于自噬體膜上。在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，觀察到的點狀聚集的數(shù)目即為自噬體的數(shù)量。

自噬體內(nèi)膜上的LC3在溶酶體中被降解，因此，LC3的整體降解量可以通過GFP-LC3熒光的降低進(jìn)行流式細(xì)胞儀定量檢測。

2）RFP-GFP-LC3 雙熒光指示系統(tǒng)

溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境導(dǎo)致GFP熒光信號淬滅，而紅色熒光蛋白對酸性環(huán)境具有很好的耐受性，可以構(gòu)建RFP-GFP-LC3串聯(lián)體。自噬形成時，自噬體呈黃色標(biāo)記（綠色和紅色圖像重合），自噬溶酶體呈紅色標(biāo)記。

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