WB樣本粘稠怎么辦?
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
你是否會碰到這樣的問題:在提取WB樣本的時候,加入裂解液后,離心發(fā)現(xiàn)管內(nèi)有非常多的膠狀物質(zhì),非常粘稠,即使多加裂解液也是無用,還會使得蛋白濃度降低。蛋白樣本若出現(xiàn)粘稠的情況,會對后續(xù)的檢測造成一定的影響,導致檢測結(jié)果不可靠,所以今天我們來研究一下導致的原因——普拉特澤生物承接WB等分子檢測相關(guān)服務上萬例,積累了操作大量經(jīng)驗,為大家詳細分享WB樣本粘稠問題,同時為廣大科研工作者開展線上的理論培訓與線下實操,可承接wb實驗外包服務。
【一】、蛋白樣本粘稠會造成什么情況?
1.樣品洗液困難:堵塞移液器:離心后,由于樣品粘稠,膠狀物會堵塞移液器頭,導致移液后上清液所剩無幾;無法分離上清液:樣品太過粘稠,移液時容易整體帶出,無法有效分離上清液。
2.無法測定及定量:樣品粘稠無法成為均一液體,導致蛋白定量(如使用BCA法)時OD值異常,無法進行準確的定量測定。
3.上樣困難:盡管加了loading buffer進行煮樣,上樣樣品仍然特別粘稠,很難加入到膠孔中
電泳結(jié)果不佳:SDS-PAGE時,粘稠的樣品會卡在點樣孔里,導致條帶不成直線,有嚴重拖尾,條帶不集中
4.蛋白丟失:粘稠物包裹蛋白導致無法釋放,樣品很難跑出理想的結(jié)果,有時甚至是完全沒有條帶。
【二】那么是什么造成蛋白質(zhì)樣本如此粘稠的呢?
1.核酸殘團:在細胞裂解過程中,細胞中的DNA纏繞其他大分子物質(zhì),形成粘稠的“核酸殘團”。這些核酸殘團與蛋白質(zhì)聚集在一起,使得樣本變得粘稠。核酸殘團的存在會降低蛋白提取效率,使得蛋白質(zhì)丟失。
2.細胞碎片和油脂:裂解后的樣本中可能含有細胞碎片,如油脂、難溶蛋白等。這些成分也會增加樣本的粘稠度。
【三】如何有效降低蛋白樣本的粘稠?
1.使用柱式法提取蛋白:柱式法蛋白提取通過優(yōu)化的裂解液配方和離心管柱技術(shù),可以有效提高裂解效率,阻截核酸,減少樣本粘稠度。
2.超聲破碎:利用超聲波的能量破壞蛋白復合物,切割染色質(zhì),改善樣本粘稠狀態(tài)。但是超聲處理可能產(chǎn)生泡沫,影響蛋白濃度測定及后續(xù)實驗。超聲產(chǎn)生的熱量可能導致蛋白質(zhì)變性或降解,因此應避免用于磷酸化等敏感蛋白的研究。
3.使用核酸酶降解核酸:核酸酶可以降解樣本中的核酸,減少核酸殘團的形成,從而降低樣本粘稠度。
4.延長煮沸時間:在加入上樣緩沖液后,適當延長煮沸時間,可以使結(jié)合在基因組DNA上的蛋白充分釋放,同時導致基因組DNA的部分斷裂,降低樣本粘稠度。
5.反復抽吸:使用注射器反復抽吸樣本,可以打斷基因組DNA,改善樣本粘稠狀態(tài)。
冰凍三尺,非一日之寒,普拉特澤致力于幫助廣大科研工作者解決WB實驗過程中的各方面問題,不但授人以魚,亦授人以漁。