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        今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是免疫組化（IHC）常見問題及其解決方法。免疫組化（IHC）染色是一項(xiàng)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)，雖然其總體實(shí)驗(yàn)難度較低，但是忽略的細(xì)節(jié)容易讓結(jié)果出現(xiàn)各種各樣的問題。今天病理平臺的技術(shù)就跟大家來盤一盤，我們承接免疫組化/IHC代做時出現(xiàn)過的問題及其解決方法。總是遇到各種問題的實(shí)驗(yàn)小白可以學(xué)習(xí)閃避很多實(shí)驗(yàn)和各種常見問題。

        免疫組化問題一：無信號-陰性結(jié)果

        1、真陰性結(jié)果：組織或細(xì)胞不表達(dá)抗原，無法檢測到相應(yīng)信號;或抗原表達(dá)量太低，無法檢測到相關(guān)信號。

        2、假陰性結(jié)果

        （1）染色前錯誤：切片時選錯蠟塊或拿錯切片，這種情況可用H&E染色驗(yàn)證。

        （2）染色操作錯誤：

        ①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)加的某種試劑，包括抗抗、底物等。

        ②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否在足夠的溫度條件下滿足足夠的時間。

        ③復(fù)查抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗四配。

        ④檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體。

        ⑤檢查抗體稀釋比及所使用的抗體稀釋液是否合適。

        ⑥確定組織或細(xì)胞標(biāo)本的儲存條件。

        ⑦檢查底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標(biāo)記有的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些

底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。

        ⑧檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，沖洗液的pH值也很重要，與過氧化物酶底物適配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。

        ⑨檢查復(fù)染、脫水、透明和封片劑是否和所使用的色原匹配。熒光素染色封片要選用水溶性封片劑，AEAPRed/FastRed和其它水溶性染料不能用二甲苯有機(jī)溶劑透明。

      問題二：信號弱一弱陽性結(jié)果

        如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本陽性強(qiáng)度較弱，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：

        1、標(biāo)本的固定方式：固定劑不適當(dāng)，固定時間過長或過短，固定溫度過高，都會影響到所檢測的抗原數(shù)量和質(zhì)量。

        2、抗原修復(fù)方式不當(dāng)：由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，大部分抗體在做免疫組化時需用抗原熱修復(fù)或酶消化等方法使抗原暴露，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照試劑生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。同時亦須注意，小部分抗體在進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)時是不需要進(jìn)行抗原修復(fù)操作的，如果進(jìn)行了抗原修復(fù)操作反而可能會使陽性著色減弱。

        3、第一抗體效價太低或被過度稀釋，或者孵音的溫度/時間不合適也可導(dǎo)致弱陽性結(jié)果。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度。

        4、切片上如遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。

        5、孵育時切片是否水平放置，否則會導(dǎo)致抗體流失。

        好了，免疫組化的常見問題及其解決方法上篇咱們就講完啦，想要深入學(xué)習(xí)的朋友可以點(diǎn)擊《免疫組化/IHC 理論+實(shí)操》 來學(xué)習(xí)理論和實(shí)操，還有更多的免疫組化常見問題我們來看看《免疫組化/IHC常見問題及其解決方法（下）》，也歡迎大家留言分享自己在做免疫組化實(shí)驗(yàn)時遇到的問題和摸索出來的解決方法分享學(xué)習(xí)哦，咱們下篇見！