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        大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起來學習探針法檢測SNP的詳細操作步驟，SNP全稱單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組上單個核苷酸的變異，變異類型包括轉換、顛換、缺失和插入。普拉特澤——表達檢測平臺專業(yè)承接SNP檢測代做外包服務與生物醫(yī)學細胞實驗技術培訓，鑄就你基礎醫(yī)學科研的金身。那現(xiàn)在我們來一點一點看Taqman探針法檢測SNP的詳細內容！

        Taqman探針法將樣品與反應組分在封閉的體系中進行簡單混合，通過檢測PCR反應過程中的熒光變化，可以實時檢測SNP位點的基因分型。由于無需任何PCR之后的操作，這樣就避免了PCR之后的人力成本與PCR后處理過程中的交叉污染。由于PCR反應的靈敏性，這種方法需要的樣本含量極少。同時，隨著日益成熟的熒光定量PCR儀，可以在一個反應板中進行大批量樣本的同時檢測。

        Taqman探針法檢測SNP的原理是：利用Taq DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活力對探針本身進行酶切。Taqman探針的兩端分別標記有熒光基團和對應的淬滅基團，當探針完整時，oligo相當于一條鎖鏈將熒光基團和淬滅基團緊緊拴在一起，導致熒光基團發(fā)出的光被淬滅基團吸收。當探針被Taq酶切斷之后，熒光基團得以釋放從而導致熒光值上升，熒光值的變化會被熒光定量PCR儀或者其他檢測儀器記錄下來。

        對于SNP分型檢測，體系中會含有針對不同基因型的探針（如下圖Probe1和Probe2），兩種探針5端通過標記不同的熒光基團進行區(qū)分（通常使用的是FAM和VIC）。他們的序列中包含匹配不同基因型的堿基，堿基錯配將導致探針與模板的結合能力以及被切割的概率大大降低。因此，當基因型為純合子時，只會檢測到單獨一種熒光信號，而對于雜合子，兩種熒光信號都將被檢測到。

        那有哪些因素會影響到探針對SNP分型效果呢？

        首先，探針中錯配的堿基需要對整條探針與模板的結合能力有比較大的影響，即含有錯配的探針Tm值需比正常探針低得多。這對探針的長度及SNP位點在探針中的位置有較高的要求。

        第二，由于分型探針是在同一個反應體系中，因此不同的探針與模板的結合是一種競爭狀態(tài)，這就要求不同的分型探針與模板結合的位置是需要重疊的，這樣才能保證一個模板上只結合一種探針。

        第三，Taqman探針的水解是先解離一部分，然后再水解。Taq酶的5’核酸外切酶活性實際上識別的是一個Y型結構，其游離的單鏈至少為1~3個核苷酸，此時要求錯配的探針應當更傾向于從模板上解離下來，而不是繼續(xù)留在模板上被Taq酶水解。

        為了能得到最合適的實驗結果，我們列出了探針設計的各種原則：
          1. 避免5’端第一個核苷酸為G，鳥嘌呤核苷酸對臨近的熒光基團有明顯的淬滅作用，導致結果信號值低。

        2. 探針的Tm值需要比引物的Tm值高5~8°C，通常情況下為65~67°C

        3. 為了增加探針的單堿基區(qū)分度，探針長度不宜過長，但同時MGB探針也不宜短于13個核苷酸。

        4. 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，尤其是連續(xù)的G，多余4個連續(xù)的G存在時，探針容易形成G四聯(lián)體或其他高級結構，不利于其與模板的結合。

        5. 區(qū)分SNP的堿基應當位于探針中間1/3的位置去（將探針平分三段，SNP位于中間那段）。如果這段位置不合適，設計不出優(yōu)秀的探針，可以將SNP位置向3’端挪動，以更加靠近MGB基團。不要將SNP分型位點安排到最后的三個核苷酸中。

        6. 由于G核苷酸形成高級結構及對熒光團的淬滅特性，探針的G殘基數(shù)量不宜超過C的數(shù)量，如果有此情況，建議將探針設計在互補鏈上。

        好啦，那關于Taqman探針法檢測SNP分型咱們就講解到這里啦，如果您還有其他的問題或者有SNP檢測代做的需求歡迎隨時官網(wǎng)留言，我們下期見~