“生活中，我們在漸漸死亡”。

實際上，在處理細(xì)胞實驗中，我們每做一個實驗，樣本中總是會有一些細(xì)胞死亡。這在有些檢測時可能不重要，但有些檢測中則非常麻煩。下面小編就來為大家介紹一下怎么用流式鑒別細(xì)胞死活

為什么要鑒別細(xì)胞死活

流式細(xì)胞術(shù)是一個容易被死細(xì)胞所干擾的技術(shù)，因為：

1. 死細(xì)胞容易攝取抗體和探針，導(dǎo)致明顯的非特異性染色。

2. 死細(xì)胞自發(fā)熒光特別強。

最后導(dǎo)致背景熒光增強，使得我們無法觀察到一些標(biāo)記的弱陽性表達(dá)。

死細(xì)胞還可能會釋放DNA，DNA非常粘稠，所以最后會導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，既影響結(jié)果，又容易堵塞管路。在流式分選中，一般都不愿意分選活力不好的細(xì)胞。

怎樣解決死細(xì)胞的問題

我們需要確保細(xì)胞的培養(yǎng)基中含少量DNAse，以保證細(xì)胞單個存在，不被死細(xì)胞產(chǎn)生的DNA影響而粘附在一起。

利用死細(xì)胞的一些特性來區(qū)分它們。當(dāng)細(xì)胞死亡時，它們就會失去膜的完整性，膜的滲透性增強，這就是為什么我們在標(biāo)記抗體時死細(xì)胞容易發(fā)生非特異性染色的緣故，但同時，我們也可以利用這個特性來幫助我們鑒別死細(xì)胞，目前有兩個方法-----使用DNA染料或蛋白染料。

DNA結(jié)合染料

PI、DAPI、7-AAD等DNA染料利用死細(xì)胞膜通透性增大、不破膜的情況下DNA染料即可進(jìn)入的特點區(qū)分出死細(xì)胞，但所用染料濃度、時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞周期所用的濃度，并且不需要固定。

PI檢測通道：使用488 nm激發(fā)，用610/20 BP收集

DAPI檢測通道：最好用355nm激發(fā)，用440/40BP收集；也可以用405nm激發(fā)，450/50BP收集

7-AAD檢測通道：用488nm激發(fā)，用670/14BP收集

染色方法:

1. 用0.5mL 1×PBS重懸細(xì)胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，終濃度分別為PI（5 μg/mL）、DAPI（500-1000 ng/mL）、7-AAD（2.5 μM）

3. 加入上述染料后，盡快上機，一般不要超過5分鐘（有些廠家說明書寫著10分鐘，可能與濃度有關(guān)，可按照說明書操作）。

在上面的步驟中是把染料直接加入活細(xì)胞標(biāo)本中。如果將PI等加入經(jīng)過固定的細(xì)胞中會使所有的細(xì)胞都發(fā)生滲透性增高，結(jié)果就是所有的細(xì)胞都染上PI。在一些需要檢測胞內(nèi)抗原而不得不破膜的標(biāo)本中，這時就沒法用PI等DNA染料來區(qū)分死細(xì)胞了。

蛋白結(jié)合染料

蛋白結(jié)合染料有時候又被稱為胺類反應(yīng)性染料或live/dead可固定染料。它們也是基于死細(xì)胞胞膜受損的原理，但略有不同，它們不是結(jié)合到DNA，而是結(jié)合到蛋白質(zhì)，這類染料需要在固定前加入樣本中?；罴?xì)胞由于細(xì)胞表面有少量蛋白，所以會結(jié)合少量的蛋白染料，而死細(xì)胞由于染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，能夠結(jié)合大量的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，熒光會特別強。

染色完成之后，細(xì)胞就可以用多聚甲醛或乙醇等進(jìn)行固定了，固定之前的死、活細(xì)胞之間的染色水平差異會一直保留著。這種染色方法也非常簡單，只需樣本和染料直接孵育20分鐘，而且這類染料的激發(fā)和發(fā)射特性也很多，所以能挑選到一種適合你實驗的熒光標(biāo)記蛋白結(jié)合染料。