一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

二、區(qū)分凋亡和壞死

可將二者區(qū)分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細胞儀檢測等。不能將二者區(qū)分開的方法：原位末端標(biāo)記法、PI單染色法流式細胞儀檢測等。

三、樣品來源不同選擇

組織：主要用形態(tài)學(xué)方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標(biāo)記，ELISA或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細胞凋亡檢測

1、早期檢測:

1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

2) 細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測

3) 細胞色素C的定位檢測

4) 線粒體膜電位變化的檢測

2、晚期檢測：

細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。

對于晚期檢測通常有以下方法：

1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)

2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)

3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

3、生化檢測：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記（TUNEL）等

3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）

4）通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的dNTP （多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果?？勺黾毎麘乙?、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。

4、LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)

當(dāng)?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR，連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（dT）使DNA標(biāo)記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結(jié)合其它的方法來檢測細胞凋亡。

其它方法：

1）Telemerase Detection (端粒酶檢測)

端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復(fù)制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。

2）mRNA水平的檢測

研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術(shù)來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過檢測fas, bax-alpha 和bcl-X (長的) 基因的mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

5、細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：

正常狀態(tài)下，谷胱甘肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。

6、細胞色素C的定位檢測

細胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結(jié)合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)：細胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關(guān)系

2）近年來陸續(xù)有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動態(tài)的由多個蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點的通透性轉(zhuǎn)變孔道(PT孔道)能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。

線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據(jù)：

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。

2）形態(tài)學(xué)觀察，看到細胞數(shù)目有限，統(tǒng)計學(xué)上的準(zhǔn)確性受影響；

3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例；

4）流式細胞術(shù)可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。

用于流式細胞儀檢測的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。

PI和Hoechst33342雙標(biāo)：

PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡藍色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而凋亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為凋亡細胞。

PI和Annexin-V雙標(biāo)：

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時）PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。因此細胞處于凋亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性。

五、形態(tài)學(xué)觀察

1、普通光學(xué)顯微鏡觀察

2、透射電子顯微鏡觀察

3、熒光顯微鏡觀察

1、普通光鏡下觀察：

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色

直接用倒置顯微鏡觀察：

1）細胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。

2、透射電子顯微鏡觀察

凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。

細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：

I期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；

IIa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；

IIb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3、熒光顯微鏡常用的熒光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等，Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大的細胞毒作用。

Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。

碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

注意事項：細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。