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   克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，可以反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。通過觀察單細(xì)胞集落形成情況，來計(jì)算克隆形成率，了解其增殖能力。

其技術(shù)原理：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上時(shí)細(xì)胞數(shù)量已達(dá)60個(gè)左右，此細(xì)胞群體成為克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力，各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變，通過計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，了解細(xì)胞的增殖率和對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性。軟瓊脂培養(yǎng)或平板克隆是最常用的方法。

   平板克隆形成（Colony Formation）：細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，應(yīng)用于貼壁的細(xì)胞。

 實(shí)驗(yàn)步驟

    Step1：細(xì)胞培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)

    Step2：制備單細(xì)胞懸液

   Step3：按不同的細(xì)胞濃度梯度把細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)平板

   Step4：培養(yǎng)一段時(shí)間

   Step5：觀察克隆情況，固定染色后計(jì)算克隆形成率

  軟瓊脂克隆形成（Soft Agar Colony Formation）：利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。

 實(shí)驗(yàn)步驟

   克隆形成實(shí)驗(yàn)需要注意的幾個(gè)點(diǎn)：

   1、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，0.25%胰酶消化，離心后重懸時(shí)一定要吹打成單細(xì)胞懸液?？梢赃x擇6孔板作為克隆培養(yǎng)板，按密度梯度（如100、200、300）接種進(jìn)孔板中。接種后切記晃動(dòng)平板，使細(xì)胞分布均勻。

   2、培養(yǎng)2周左右（出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)），即可固定染色。加固定液和染色液時(shí)，覆蓋住孔板底層即可。但如果長(zhǎng)時(shí)間不處理，需增加液體量，防止液體干涸，影響拍照效果。

   3、拍照時(shí)，務(wù)必使每個(gè)孔中無陰影，如無法達(dá)到，則逐個(gè)孔進(jìn)行拍照。

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