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Th17細(xì)胞簡介

輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)的T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義。β轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor b，TGF-β)、IL-6、IL-23和IL-21在Th17細(xì)胞的分化形成過程中起著積極的促進(jìn)作用，而γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)、IL-4、細(xì)胞因子信號傳送阻抑蛋白3(suppressor of cytokinesignaling 3,Socs3)和IL-2則抑制它的分化。

Th17細(xì)胞是一類產(chǎn)生IL-17的Th細(xì)胞亞群，與許多炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。大量研究表明，IL-17與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(EAE)、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等自身免疫性疾病明顯相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，被致病抗原髓鞘蛋白(PLP)致敏的CD4⁺T細(xì)胞經(jīng)IL-23刺激后可產(chǎn)生大量的IL-17，將這些產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞被動(dòng)地轉(zhuǎn)移給小鼠后可引發(fā)嚴(yán)重的EAE，給予抗IL-17中和性抗體可以部分抑制EAE的發(fā)生。Komiyama等在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎的小鼠模型中，IL-17mRNA基因水平和蛋白質(zhì)水平均升高。

大鼠外周血Th17細(xì)胞流式染色實(shí)例    

圖1 大鼠外周血Th17細(xì)胞畫門策略

Rat (Blood): IL-17A⁺ CD4⁺T cells

1. 標(biāo)志物：Th17 cells (CD3+CD4+IL-17A⁺)；

2. 流式細(xì)胞儀：CytoFLEX，Beckman Coulter；

3. 流式抗體及用量： (PE anti-rat CD3，2.5μL/test, 201411，Biolegend),FITC anti-rat CD4 (0.5μL/test, 201505, Biolegend), APC anti-rat IL17 (0.625μL/test,17-7177-81, eBioscience)；

4. 分析軟件：FlowJo V10；

5. 圈門策略及染色：見上圖。

大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離

• 血液準(zhǔn)備：取2mL外周血加入2mL生理鹽水，混勻；

• LymphoprepTM分離液（即用型）使用前平衡至室溫，在15mL離心管底部加入3mL分離液，將第1步混好的血液小心鋪在分離液上面，室溫，800g離心25 min；

• 吸取白膜層細(xì)胞到新的15m離心管中，加入10mL左右的PBS或者培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，350g離心5 min。

  

圖2 淋巴細(xì)胞分離流程圖

細(xì)胞刺激及流式染色

• 含10%FBS的1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度到4x10⁶cells/mL，取500μL細(xì)胞懸液到24孔板中，每孔加入2μL的Cell Activation Cocktail (withBrefeldin A)，在37℃的CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4.5h；

• 流式染色實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備流式上樣管，并做好相應(yīng)的標(biāo)記。

• 收集體外刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，350g離心5 min，用1mL的Cell Staining Buffer重懸細(xì)胞，350g離心5 min。

• 按照管設(shè)置分別加入相應(yīng)的表面標(biāo)記抗體，混勻后，室溫避光孵育15-20 min。

• 加入至少2mL的細(xì)胞染色液洗1次，350g離心，5 min，棄上清。

• 加入Fixation Buffer (Cat# 420801)固定細(xì)胞，每管0.5mL固定液，室溫避光孵育固定20 min。

• 350g，離心，5 min，棄上清。

• 用去離子水將10×的Permeabilization Wash Buffer (Cat# 421002) 稀釋成1×的工作液。

• 用1mL 1×的Permeabilization Wash Buffer重懸固定的細(xì)胞，350g離心5-10 min，棄上清。

• 重復(fù)步驟兩次。

• 用100μL Permeabilization Wash Buffer 重懸固定破膜后的細(xì)胞，加入特定的熒光標(biāo)記抗體（抗體量根據(jù)說明書加），室溫避光20 min。

• 用 2mL Permeabilization Wash Buffer洗細(xì)胞兩遍。350g離心5 min，棄上清。

• 加入0.5mL的Cell Staining Buffer重懸細(xì)胞。