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   大家好，今天我們來講一講用流式檢測細胞周期的實驗原理和詳細步驟，本文是普拉特澤生物根據(jù)承接的幾千例流式檢測外包實驗與同學們的技術咨詢分析，發(fā)現(xiàn)相當一部分來外包實驗和技術咨詢的問題都是流式檢測相關的實驗，特別是流式檢測細胞周期，既然這個實驗折磨了大家這么久，那這一篇，我們就來好好地給科研小白們盤一盤吧！

   一、流式檢測細胞周期實驗原理

   流式利用不同熒光物質(zhì)標記的單克隆抗體，與待測成分作用，然后上流式細胞儀檢測待測細胞。待測細胞隨流動室內(nèi)的流動鞘液排列成單列，一個個迅速通過激光聚焦區(qū)，激光在對每個細胞進行照射時可同時得到前向角散射和側(cè)向角散射2種散射光以及激發(fā)熒光標記物發(fā)出的信號，利用這些信號，可計算出相對含量，從而得到細胞群的相對比值。

   細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細胞在分裂結(jié)束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執(zhí)行一定生物學功能（G0期）。由于細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量（2N），而G2/ M期具有四倍體細胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期。

   二、流式檢測細胞周期實驗詳細步驟

   1、培養(yǎng)細胞周期待測細胞：在合適的溫度、營養(yǎng)、酸堿度條件下通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，可以借此研究細胞周期、細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等實驗。細胞培養(yǎng)時間：一般藥物等處理時間最好是大于細胞增殖一代的周期，可根據(jù)具體細胞分裂時間決定，如乳腺癌細胞我們一般處理24小時。這里就不展開講啦，感興趣的同學可以看看另一篇文章：原代細胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)該用什么方法？

   2、收集檢測細胞周期的細胞：收集細胞取適量的對數(shù)生長期細胞接種于6厘米中，在相應的條件下(如藥物)處理相應時間后，倒去培養(yǎng)基，用胰酶適度消化細胞，離心收集細胞，棄去上清。細胞數(shù)量:一般情況下，由于在細胞周期中分析的細胞數(shù)應達到1.0*104~3.0*104才具有統(tǒng)計學意義。因此，單次流式細胞儀檢測細胞周期時，1份樣品的細胞數(shù)量至少為106。

   3、清洗及固定檢測細胞周期的細胞：用PBS清洗細胞2遍，吸凈離心管殘余的PBS后，加入300微升PBS重懸，將細胞吹散，避免細胞成團，隨后將細胞懸液逐滴滴入700uL無水乙醇(預冷)，即用70-75%的乙醇固定細胞，然后4℃固定過夜。由于流式分析時需要的是單個細胞懸液，因此在操作過程中需充分混懸細胞，細胞固定后，不可過度吹打細胞，以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。

   4、再次洗滌檢測細胞周期的細胞：第二天，離心收集細胞，用移液槍吸走上清，然后用1mLPBS重懸細胞并離心清洗2~3遍。細胞可以長期保管在-20℃，可存放1個月，染色不會受影響;用PBS重懸細胞時，動作要輕柔。此外，離心速度(1200rpm/min)不要過快以免造成細胞的破裂。

   5、避光孵育待測細胞：RNA酶消化和PI染色在避光條件下，每個樣品加入1避光RNase(10mg/mL)和5 mg/m(5mg/mL)混勻后室溫避光條件下孵育30min

   6、上流式細胞儀檢測：將檢測樣品轉(zhuǎn)移到5mL的流式管后用流式細胞儀檢測細胞周期，采用flowjo或 modifit軟件進行DNA含量分析，上機檢測時，必須重懸成細胞懸液后再檢測，否則容易堵儀器管道；如果細胞過多或聚團嚴重，可先用300尼龍網(wǎng)過濾，然后再上機檢測。
   那么以上就是用流式檢測細胞周期的原理和詳細實驗步驟啦，關于流式的結(jié)果分析怎么看，請點擊：流式結(jié)果怎么看【干貨分享】
   大家都學會了嗎？還有其他技術問題或者需要流式檢測細胞周期實驗外包的朋友可以留言聯(lián)系我們哦~