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    CRISPR/Cas9技術(shù)是區(qū)別于ZFN與TALENs的最新基因編輯技術(shù)，并在近年迅速得到推廣與應(yīng)用。該技術(shù)擁有修飾效率高、操作簡(jiǎn)便、成本廉價(jià)等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因此在目前各項(xiàng)生物研究中成為最主流的基因編輯方式。
（一）技術(shù)起源與發(fā)展
CRISPR-Cas 系統(tǒng)最初是在細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的，它能夠幫助這些微生物識(shí)別和抵御外源遺傳物質(zhì)的入侵，如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒等。

2012 年，科學(xué)家詹妮弗?杜德納（Jennifer Doudna）和艾曼紐?夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）首次證明了 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在體外可以對(duì) DNA 進(jìn)行特異性切割。

2013 年，張峰等人將 CRISPR-Cas9 技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯，開啟了該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的大門。

（二）系統(tǒng)組成與結(jié)構(gòu)

Cas9 蛋白：是一種核酸內(nèi)切酶，具有切割雙鏈 DNA 的功能。它包含 RuvC1 和 HNH 樣核酸酶結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割 DNA 的兩條鏈，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂。Cas9 蛋白行使功能需要依賴向?qū)?RNA 的引導(dǎo)以及靶序列相鄰的原型間隔序列毗鄰基序（PAM）的識(shí)別。

向?qū)?RNA（gRNA）：由 CRISPR 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 crRNA 與反式激活的 tracrRNA 融合而成的單鏈引導(dǎo) RNA（sgRNA）。sgRNA 的 5′端包含與靶 DNA 互補(bǔ)的 20nt 左右的序列，用于定位需編輯的位點(diǎn)；3′端則是與 Cas9 蛋白結(jié)合的區(qū)域，通過與 Cas9 蛋白相互作用，引導(dǎo)其到達(dá)目標(biāo)基因的特定 DNA 序列上。
（三）作用機(jī)

識(shí)別與結(jié)合：sgRNA 首先與 Cas9 蛋白形成復(fù)合物，然后通過其 5′端的互補(bǔ)序列在基因組中尋找與之匹配的靶 DNA 序列。當(dāng)找到匹配的靶序列后，sgRNA-Cas9 復(fù)合物會(huì)與靶 DNA 結(jié)合，同時(shí)識(shí)別靶序列下游的 PAM 序列，PAM 序列一般為 5′-NGG，它作為一種識(shí)別信號(hào)，確保 Cas9 蛋白能夠準(zhǔn)確地結(jié)合到目標(biāo) DNA 上。

切割作用：在結(jié)合到靶 DNA 后，Cas9 蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域會(huì)被激活，分別在 PAM 序列上游第 3 個(gè)堿基處對(duì) DNA 的兩條鏈進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂。這種雙鏈斷裂是細(xì)胞內(nèi) DNA 修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)的信號(hào)，細(xì)胞會(huì)通過非同源末端連接或同源重組修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)斷裂的 DNA。

修復(fù)與編輯：非同源末端連接是一種易錯(cuò)的修復(fù)方式，在修復(fù)過程中常常會(huì)引入插入或缺失突變，導(dǎo)致基因閱讀框發(fā)生改變，從而使基因功能喪失，實(shí)現(xiàn)基因敲除的效果。而如果在細(xì)胞中同時(shí)提供含有目的基因片段的供體 DNA 模板，細(xì)胞則會(huì)通過同源重組修復(fù)機(jī)制，以供體 DNA 為模板，將目的基因片段精準(zhǔn)地插入到靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因敲入或替換等精確編輯。
（四）CRISPR/Cas9的優(yōu)勢(shì)

①高效性：能夠在多種細(xì)胞類型和物種中實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯，大大提高了基因編輯的成功率和效率，為大規(guī)模的基因功能研究和基因治療等應(yīng)用提供了有力支持。

②簡(jiǎn)便性：與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的構(gòu)建和操作相對(duì)簡(jiǎn)單。只需要設(shè)計(jì)和合成針對(duì)目標(biāo)基因的 sgRNA，并將其與 Cas9 蛋白表達(dá)載體共同導(dǎo)入細(xì)胞中，即可實(shí)現(xiàn)基因編輯，無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程和基因克隆等操作，降低了實(shí)驗(yàn)難度和成本。

③特異性：通過合理設(shè)計(jì) sgRNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組中特定目標(biāo)基因的精確編輯，具有較高的靶向特異性。同時(shí)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，對(duì)脫靶效應(yīng)的控制也越來(lái)越有效，進(jìn)一步提高了編輯的準(zhǔn)確性和可靠性。

④多重編輯能力：可以同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)針對(duì)不同靶位點(diǎn)的 sgRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因或同一基因的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)編輯，能夠更全面地研究基因之間的相互作用和復(fù)雜的生物學(xué)過程。

（五）CRISPR/Cas9的局限性

①脫靶效應(yīng)：盡管經(jīng)過不斷優(yōu)化，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)仍然存在一定程度的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，即可能會(huì)在非目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生切割和編輯，導(dǎo)致意想不到的基因突變，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，甚至可能產(chǎn)生潛在的安全隱患。    

②編輯效率問題：在某些細(xì)胞類型或特定的基因組區(qū)域，CRISPR-Cas9 的編輯效率可能不夠理想，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的編輯效果，需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件或采用其他輔助手段來(lái)提高編輯效率。           

③PAM 序列限制：Cas9 蛋白識(shí)別的 PAM 序列相對(duì)有限，這在一定程度上限制了可編輯的靶點(diǎn)范圍。對(duì)于一些缺乏合適 PAM 序列的基因區(qū)域，可能無(wú)法直接使用常規(guī)的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行編輯，需要開發(fā)具有不同 PAM 特異性的 Cas9 變體或其他基因編輯工具來(lái)解決。 

④倫理和法律問題：隨著 CRISPR-Cas9 技術(shù)在人類基因編輯等領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸深入，引發(fā)了一系列倫理和法律方面的爭(zhēng)議和擔(dān)憂，如生殖細(xì)胞基因編輯可能帶來(lái)的遺傳改變和倫理風(fēng)險(xiǎn)等，我們需要在技術(shù)發(fā)展的過程中建立健全相應(yīng)的倫理準(zhǔn)則和法律法規(guī)來(lái)規(guī)范其應(yīng)用。