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基于 CRISPR - Cas9 產(chǎn)生的雙鏈斷裂，利用細(xì)胞的同源重組（HR）修復(fù)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)基因敲入。在提供含有目的基因片段的供體 DNA 模板的情況下，細(xì)胞可以以該模板為參照，將目的基因整合到基因組的目標(biāo)位置。這個(gè)供體 DNA 模板兩側(cè)需要有與目標(biāo)基因組切割位點(diǎn)兩側(cè)同源的序列，以引導(dǎo)同源重組的發(fā)生。
應(yīng)用場(chǎng)景
    ①基因治療：對(duì)于一些單基因遺傳病，如鐮狀細(xì)胞貧血，其病因是 β - 珠蛋白基因發(fā)生突變?？梢岳?CRISPR - Cas9 將正常的 β - 珠蛋白基因敲入患者自身造血干細(xì)胞的基因組中，使這些干細(xì)胞能夠產(chǎn)生正常的血紅蛋白，從而治療疾病。
    ②構(gòu)建基因表達(dá)模型：可以將帶有特定標(biāo)簽（如熒光蛋白基因）的序列敲入目標(biāo)基因的特定位置，通過(guò)觀察熒光信號(hào)來(lái)研究目標(biāo)基因的表達(dá)模式和定位
示例
    在果蠅研究中，為了研究特定基因在神經(jīng)元中的表達(dá)情況，將綠色熒光蛋白（GFP）基因敲入目標(biāo)基因的起始密碼子附近。通過(guò) CRISPR - Cas9 系統(tǒng)在目標(biāo)基因位置產(chǎn)生雙鏈斷裂，同時(shí)提供含有 GFP 基因以及與目標(biāo)基因切割位點(diǎn)兩側(cè)同源序列的供體 DNA。在 HR 修復(fù)過(guò)程中，GFP 基因整合到目標(biāo)基因位點(diǎn)，使果蠅神經(jīng)元中表達(dá)的目標(biāo)基因帶有 GFP 標(biāo)簽，方便觀察神經(jīng)元中該基因的表達(dá)和分布。 
                              （三）基因激活（Activation）或抑制（Repression）策略

原理

激活策略：通過(guò)改造 Cas9 蛋白形成激活型 Cas9（dCas9 - activator），dCas9 蛋白失去了核酸內(nèi)切酶活性，但可以在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。同時(shí)，dCas9 - activator 融合轉(zhuǎn)錄激活因子，如 VP64 等，這些激活因子可以招募 RNA 聚合酶等轉(zhuǎn)錄機(jī)器，從而促進(jìn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄激活。

在干細(xì)胞分化研究中促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，利用 dCas9 - activator 靶向心肌細(xì)胞特異性基因（如 Myh6）的啟動(dòng)子區(qū)域，激活該基因的表達(dá)。且結(jié)合其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，引導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化，為心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究提供策略。