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        DNA甲基化實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物總結(jié)分享，上期我們講到介紹完了DNA甲基化的實(shí)驗(yàn)介紹，給第一次接觸這個(gè)實(shí)驗(yàn)的科研小白們做了一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹，不記得的可以回去有觀看哦——《DNA甲基化實(shí)驗(yàn)介紹》。普拉特澤專業(yè)承接DNA甲基化實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，積累豐富的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，今天普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)深入的分享一下DNA甲基化檢測(cè)的操作步驟：

        DNA甲基化檢測(cè)第一步：引物設(shè)計(jì)

        在GenBank上找到待檢基因啟動(dòng)子區(qū)的原始序列，輸入到“MethPrimer”軟件中，輸入啟動(dòng)子序列，選擇“Pick primers for bisulfite sequencing PCR?or restriction PCR?”，其他參數(shù)選擇程序默認(rèn)值，點(diǎn)擊“Submit”，“MethPrimer”軟件即可顯示預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列的CpG島，及引物的相應(yīng)位置，同時(shí)也顯示設(shè)計(jì)的BSP引物。選擇多對(duì)引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定引物序列。

        DNA甲基化檢測(cè)第二步：基因組提取

        使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分別提取各樣本基因組。提供的細(xì)胞量要求大于10^6個(gè)。提取濃度在100-400 ng/μL之間，OD 260/280均在1.8-2.0之間，提取質(zhì)量合格。

        DNA甲基化檢測(cè)第三步：亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

        （1）將提取獲得的基因組DNA 3μg以無(wú)菌雙蒸水稀釋至50μL，然后加入NaOH （終濃度為0.2 M）在42℃水浴變性30 min。

        （2）依次加入30μL10mM對(duì)苯二酚（氫醌）、520μL 3 M亞硫酸氫鈉（pH=5.0要求精準(zhǔn)）至上述水浴后混合液中，輕柔顛倒混勻

        （3）加入200μL石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；50℃避光水浴16h。

        DNA甲基化檢測(cè)第四步：修飾后DNA純化回收

        修飾后的DNA使用純化試劑盒進(jìn)行過(guò)柱純化，回收后用50μl無(wú)菌雙蒸水溶解，并測(cè)定濃度。

        DNA甲基化檢測(cè)第五步：PCR擴(kuò)增

        PCR引物設(shè)計(jì)、退火溫度選擇、Taq酶及Buffer的選擇都會(huì)影響擴(kuò)增的成敗，需要不斷優(yōu)化。

        DNA甲基化檢測(cè)第六步：擴(kuò)增產(chǎn)物回收

        （1）將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，進(jìn)行膠回收，步驟如下：在紫外燈下，切下包含目的片段的膠條。用天平稱量總重量并減去空管的重量算出凝膠的重量，按100mg=100μL來(lái)計(jì)算凝膠的體積，并加入1倍凝膠體積的Binging Solution置于65℃水浴鍋內(nèi)將凝膠徹底融化。期間適當(dāng)搖晃EP管，加快凝膠的溶解。

        （2）將上述液體全部轉(zhuǎn)移到濾柱內(nèi)，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復(fù)一次）。然后棄掉管內(nèi)液體，向柱內(nèi)加入500μL的WA Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S。棄掉管內(nèi)液體，再向柱內(nèi)加入500μL的Wash Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復(fù)一次）。然后空離3 min。將濾柱放置在一個(gè)新的1.5mL EP管中，室溫晾干。最后在柱子內(nèi)加入35 μL的ddH2O，靜置5min，13000轉(zhuǎn)離心1.5 min。為了提高回收率，可將溶解的DNA再次加入柱子內(nèi)離心一分鐘。棄掉柱子，即為回收的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，并測(cè)定濃度。

        DNA甲基化檢測(cè)第七步：進(jìn)行重組反應(yīng)

        將回收的擴(kuò)增片段與T克隆載體進(jìn)行重組，完成回收目的基因與載體的重組過(guò)程。

        DNA甲基化檢測(cè)第八步：轉(zhuǎn)化

        （1）將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上（4℃）待其自然解凍后，取10μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中于冰上（4℃）放置30 min。

        （2）之后于42℃水浴中熱擊90 S。然后迅速置于冰上（4℃）放置2-3 min。

        （3）加入500μL不含抗生素的SOC培養(yǎng)基于37℃,225rpm振蕩培養(yǎng)45 min。

        （4）3000轉(zhuǎn)離心2 min，棄掉900μL的上清液，將管底的菌液吹打散開(kāi)，加入到含有載體上對(duì)應(yīng)抗性（氨芐或卡那等）的培養(yǎng)平板中，用滅菌的涂布器涂勻（涂布器的溫度不能太高，以免燙死菌體），倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。

        DNA甲基化檢測(cè)第九步：克隆鑒定

        挑起平板多個(gè)克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，陽(yáng)性克隆子再進(jìn)行測(cè)序鑒定，保證最終拿到5個(gè)有效樣品測(cè)序數(shù)據(jù)。

        好了，實(shí)驗(yàn)步驟的詳細(xì)介紹我們就分享到這里了，有看不懂問(wèn)題的可以留言給客服，技術(shù)會(huì)一一解答的哦，當(dāng)然需要DNA甲基化檢測(cè)的老師們也歡迎隨時(shí)聯(lián)系我們。