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今天普拉特澤生物帶我們講：流式檢測實(shí)驗(yàn)報(bào)告

最近有做流式的朋友來找我們咨詢：

“流式檢測實(shí)驗(yàn)操作是怎么樣的呢？”

我們經(jīng)過不斷的嘗試，總結(jié)了一些小小經(jīng)驗(yàn)，分享給大家，希望能對(duì)各位做流式的朋友們有所幫助。

下面我們一起看看流式檢測實(shí)驗(yàn)報(bào)告——細(xì)胞周期檢測

流式細(xì)胞術(shù)檢測THP-1-oe-NC、THP-1-oe-SLC25A37的周期情況變化。
二、實(shí)驗(yàn)樣品

1.實(shí)驗(yàn)樣本

2.實(shí)驗(yàn)參數(shù)

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、流式檢測細(xì)胞周期

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

 根據(jù)周期檢測結(jié)果可知，2組細(xì)胞組間無明顯差異。
五、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能（G0期）。

由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/ G0 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量（2N），而 G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量（4N） ,而S期的DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0 期，S期和G2/M 期,獲得的流式直方圖對(duì)應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。

六、實(shí)驗(yàn)通用儀器及試劑

1. 主要儀器

2.主要試劑

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1.細(xì)胞復(fù)蘇

(1) 將ddH₂O預(yù)溫至37℃。

(2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺(tái)。

(4) 在超凈臺(tái)中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5) mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6) 48小時(shí)后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。

 2. 細(xì)胞預(yù)處理

 THP-1-oe-NC、THP-1-oe-SLC25A37細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

  3. 細(xì)胞處理

        (1) 鋪板：處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞直接收集離心），按實(shí)驗(yàn)需要接種于6cm皿中，根據(jù)細(xì)胞大小和形狀調(diào)整接板細(xì)胞量。

         (2) 培養(yǎng)：37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至50%~60%匯合度進(jìn)行處理。

   4.細(xì)胞收集及流式細(xì)胞周期檢測

   （1）懸浮細(xì)胞直接離心收集；貼壁細(xì)胞用胰酶消化收集，并用含有10%FBS的培養(yǎng)基中和，收集1~5×106個(gè)細(xì)胞

   （2）1500 rpm離心5 min，除去上清，PBS洗滌細(xì)胞2次

   （3）去除上清，加入200 μl細(xì)胞周期快速檢測試劑輕柔混勻，制成單細(xì)胞懸液

   （4）在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測

   （5）打開電腦和流式儀器及配套軟件，記錄開機(jī)時(shí)間

   （6）點(diǎn)開機(jī)器“開機(jī)流程”，按提示放入ddH2O流式管（體積至少2 mL）

   （7）點(diǎn)擊“質(zhì)控/標(biāo)準(zhǔn)化”進(jìn)行質(zhì)控流程

   （8）點(diǎn)擊新建實(shí)驗(yàn)并命名

   （9）新建兩個(gè)散點(diǎn)圖及一個(gè)直方圖，圖一橫縱坐標(biāo)為“FSC”“SSC”，圖二橫縱坐標(biāo)為“PE-A”“PE-H”，圖三橫坐標(biāo)為“PE-A”

   （10）上樣對(duì)照組，點(diǎn)擊運(yùn)行，調(diào)整電壓參數(shù)，大約55左右，設(shè)置坐標(biāo)軸（橫坐標(biāo)最大值=縱坐標(biāo)最大值）、第一門及第二門

   （11）點(diǎn)擊記錄，最后一門收樣1×104個(gè)細(xì)胞以上

   （12）保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可用配套的流式軟件直接分析或者導(dǎo)出FCS文件在modfit中分析

   （13）點(diǎn)擊“流式儀”中“關(guān)機(jī)流程”，關(guān)閉機(jī)器，清理廢液

今天關(guān)于流式檢測實(shí)驗(yàn)就分享到這兒啦~如果您在實(shí)驗(yàn)過程中遇到技術(shù)問題，或者需要實(shí)驗(yàn)外包和代做，可與我們技術(shù)老師聯(lián)系18570028002（微信同號(hào)）