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  免疫熒光常見問題與處理方法由普拉特澤生物——病理實驗平臺總結(jié)分享，文末附上免疫熒光實操視頻供大家學習。本文根據(jù)我們承接的各類樣本免疫熒光實驗與技術(shù)咨詢總結(jié)而來，歡迎大家補充完善。

         免疫熒光常見問題一：目標蛋白的熒光很弱，導致組間差異并不明顯，造成假陰性結(jié)果

              這種情況出現(xiàn)后，首先要檢查一下抗體對不對，是否適用于你的預處理組織。有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應用于石蠟切片，就會造成弱標記或無標記現(xiàn)象，然后通過文獻等查找一下目標蛋白在該組織或細胞的表達豐度如何。此外，如果抗體修復不充分，抗原表位未完全暴露，也會出現(xiàn)弱標記現(xiàn)象。比如，盡管大多數(shù)抗體都是在酸性環(huán)境中修復，但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復，建議查看抗體說明書，嚴格按照其修復條件進行實驗。

         免疫熒光常見問題二：目標蛋白的熒光太強，甚至形成非特異性的標記，一些背景染色可能被誤認為陽性區(qū)域，造成假陽性結(jié)果

               這種情況一般出現(xiàn)在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時候。多余的抗體會吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。

               解決方法是適當降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時間，一般能夠有所改善。

          免疫熒光常見問題三：DAPI染細胞核時，加入的試劑太多，造成高背景染色

               防熒光衰減的DAPI試劑，使用時滴上一滴就能將細胞核標記，但滴加的量太多時，會造成整張圖像呈現(xiàn)出藍色的背景。因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。

           免疫熒光常見問題四：組織切片預處理不當或采用石蠟切片，導致高背景染色

               如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹底，也會造成區(qū)域性的非特異性標記。建議脫蠟一定要徹底，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。

               實驗過程中，玻片干燥了，同樣會造成高背景或大面積的非特異性標記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實驗時，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個圈，可以有效改善。

           免疫熒光常見問題五：采集圖像過程不當，導致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析

               采集圖像時不要對每一張圖像都加上標尺，否則后期采用Image J或者IPP進行分析時，這些標尺會對結(jié)果造成影響。采集圖像時，速度要快。如果激發(fā)光很長時間對準目標區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會極快，有經(jīng)驗的人都知道，不必多說。因此，目標區(qū)域較小時，一定要盡量快速采集，減少人為實驗誤差。

        以上就是我們總結(jié)的關(guān)于免疫熒光實驗的常見問題及其處理的方法，免疫熒光視頻請點擊《免疫熒光/IF染色 理論+實操》，有免疫熒代做需求的老師可直接留言，我們會馬上與您取得聯(lián)系~