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Transwell實驗介紹由普拉特澤生物品臺總結(jié)分享，細胞檢測平臺為廣大科研實驗人員提Transwell外包實驗服務，先一起來學習學習Transwell檢測實驗報告

一、實驗原理

侵襲是Transwell實驗的一種，可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，小室底部鋪了一層聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細胞外基質(zhì)，細胞欲進入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。通過結(jié)晶紫然后后測定細胞計數(shù)值可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

二、實驗通用儀器及試劑

   1.主要儀器

2. 主要試劑

三、實驗步驟

1. 細胞復蘇

(1)     將ddH₂O預溫至37℃。

(2)     戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3)     完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進超凈臺。

(4)     在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5)     1mL培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細胞培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6)     48小時后換液，細胞融合接近80%時即可傳代。

2. 細胞預處理

MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.細胞轉(zhuǎn)染

(1)     鋪板：處于對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，按實驗需要接種于6cm皿中，根據(jù)細胞大小和形狀調(diào)整接板細胞量。

(2)     培養(yǎng)：37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞長至50%~60%匯合度進行轉(zhuǎn)染。

(3)     質(zhì)粒和脂質(zhì)體準備：用500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育8μg的質(zhì)粒；500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育16μL的 Lipo3000，靜置5 min；將含質(zhì)粒和含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基混合，混勻后室溫靜置20 min。

(4)     棄去板中原有培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，加入混合液，4-6 h后換含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

4.侵襲實驗

(1)     用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，小室室各加100 μL（20-30 μg/孔），放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現(xiàn)“白色層”取出小室。

(2)     轉(zhuǎn)染48 h后分別消化收集各組細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞。

(3)     取出小室，加入500 μL無血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中。

(4)     吸掉已充分浸潤基底膜后的侵襲小室內(nèi)的培養(yǎng)基。

(5)     加500 μL的含有10% FBS的培養(yǎng)基至下室（侵襲小室外，24孔板孔內(nèi)）；加300 μL已調(diào)節(jié)好細胞密度的細胞懸液（5×10⁴個）至侵襲小室內(nèi)；置于37℃、5% CO₂細胞培養(yǎng)箱48 h。

(6)     取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，用棉簽輕柔擦拭以去除侵襲小室內(nèi)未侵過基底層膜的細胞，以及基底層（Matrixgel），小心操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜。

(7)     在新的24孔板孔中加500 μL結(jié)晶紫，分別將侵襲小室浸入染色10 min。

(8)     用PBS沖洗掉侵襲小室上多余的染料，置于空氣中干燥。

(9)     100倍顯微鏡拍照，再用PS進行細胞計數(shù)，計算各孔的穿過去的細胞數(shù)量。

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