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  前兩篇我們總結(jié)了Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)報(bào)告；今天來(lái)重點(diǎn)學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)流程，下面鏈接可以直接點(diǎn)開跳轉(zhuǎn)哦。
上篇：Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告【整理】
中篇： Transwell遷移實(shí)驗(yàn)報(bào)告【細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包】

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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDC20-sgRNA3或SP600125處理后其侵襲能力的變化。

二、實(shí)驗(yàn)樣品及分組

1. 實(shí)驗(yàn)樣本

備注：包括干預(yù)細(xì)胞用的相關(guān)試劑均按實(shí)驗(yàn)樣品登記，每行登記一個(gè)或一組獨(dú)立樣品

2. 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞：Hela

分組：sgRNA-NC、CDC20-sgRNA3

處理：Con（0.1% DMSO）、SP600125處理（20 μM，48h）

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)材料

1. 主要實(shí)驗(yàn)儀器

2. 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材

五、實(shí)驗(yàn)原理

陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室最方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法；由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過(guò)24小時(shí)。

侵襲：侵襲是Transwell實(shí)驗(yàn)的一種，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，小室底部鋪了一層聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過(guò)聚碳酸酯膜。通過(guò)結(jié)晶紫然后后測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)值可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.細(xì)胞復(fù)蘇

(1) 將ddH₂O預(yù)溫至37℃。

(2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH₂O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。

(3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺(tái)。

(4) 在超凈臺(tái)中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。

(5) 1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

(6) 48小時(shí)后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃飽和濕度、含5%CO₂的孵箱中培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

(1) 鋪板：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板（2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔），根據(jù)細(xì)胞大小和形狀調(diào)整接板細(xì)胞量。

(2) 培養(yǎng)：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%~60%匯合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

(3) 質(zhì)粒和脂質(zhì)體準(zhǔn)備：用125μL不含血清的培養(yǎng)基孵育4μg目的片段；125μL不含血清的培養(yǎng)基孵育8μL Lipo漢恒，靜置5min；將含質(zhì)粒和含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基混合，混勻后室溫靜置20min。

(4) 棄去板中原有培養(yǎng)基，把混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中；4~6h后換成完全培養(yǎng)基。

(5) 繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。

4. 侵襲實(shí)驗(yàn)

(1) 用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，小室各加100μl（20-30μg/孔），放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現(xiàn)“白色層”取出小室；

(2) 取出小室后，加入500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中水化30min；

(3) 吸掉已充分浸潤(rùn)基底膜后小室內(nèi)的培養(yǎng)基；

(4) 侵襲：胰酶消化收集狀態(tài)良好的目的細(xì)胞（已轉(zhuǎn)染），制成單細(xì)胞懸液（無(wú)血清培養(yǎng)基配置，藥物處理組含藥物）；上室加200μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液（2×10⁴個(gè)）；下室加500μL全培養(yǎng)基（小室外，24孔板孔內(nèi)；藥物處理組含藥物）；

(5) 于37℃、5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間；

(6) 用4%多聚甲醛室溫固定20min，用棉簽輕柔擦拭以去除侵襲小室內(nèi)未侵過(guò)基底層膜的細(xì)胞，以及基底層（Matrigel），小心操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜；

(7) 在新的24孔板孔中加500μL結(jié)晶紫，分別將侵襲小室浸入室溫染色10 min；

(8) 用PBS沖洗掉小室上多余的染料，置于空氣中晾干；

(9) 100倍顯微鏡拍照，再用PS計(jì)數(shù)，計(jì)算各孔穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量。

好啦，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)報(bào)告我們就簡(jiǎn)單介紹到這里啦，同學(xué)們有沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)單的了解呢？不懂得可以給客服留言技術(shù)給您詳細(xì)解答。下一篇再詳細(xì)為大家介紹Transwell誘導(dǎo)單層細(xì)胞屏障，普拉特澤生物大家透徹Transwell實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)過(guò)程。當(dāng)然若果您有 Dot Blot實(shí)驗(yàn)方法或其他醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)外包的需求，歡迎隨時(shí)咨詢哦