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        大家好！今天普拉特澤生物病理技術(shù)分享的就是免疫熒光/IF染色實(shí)驗的操作步驟！上期給初次接觸到免疫熒光的小白們簡單介紹了一下免疫熒光技術(shù)，忘記回去復(fù)習(xí)哦。普拉特澤生物承接的免疫熒光代做實(shí)驗主要是細(xì)胞與組織樣本，我們總結(jié)出來一套高效專業(yè)的實(shí)驗步驟，文末附上免疫熒光理論實(shí)操視頻教程，歡迎大家學(xué)習(xí)指正！

        以某細(xì)胞樣本為例：

        一、準(zhǔn)備免疫熒光所需的儀器與試劑：

        CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、離心機(jī)、超凈工作臺、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、抗生素

        二、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)操作

        1.在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用生理鹽水浸洗3次；

        2.用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，生理鹽水浸洗玻片3次；

        3.0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透15 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；

        4.生理鹽水浸洗玻片3次，吸干生理鹽水；

        5.每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗，4℃孵育過夜；

        6.加熒光二抗：生理鹽水浸洗爬片3次，每次3 min，吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h，生理鹽水浸洗3次。注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量避光操作；

        7.復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，生理鹽水4次洗去多余的DAPI；

        8.在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

        以某組織樣本為例：

        一、準(zhǔn)備免疫熒光所需的儀器與試劑：

        生化培養(yǎng)箱、微波爐、生物組織攤烤片機(jī)、普通冰箱、蓋玻片、載玻片、無水乙醇、3%雙氧水、中性樹膠、二甲苯、PBS緩沖粉、檸檬酸緩沖液

        二、組織免疫熒光技術(shù)操作

        1.60℃烤片30 min；

        2.切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每級放置5-10 min。再用蒸餾水浸洗5 min；

        3.熱修復(fù)抗原：將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）,微波爐高火加熱8 min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后PBS（pH7.2~7.6）洗滌3 min x 3次；

        4.加入3% H2O2，室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。PBS沖洗3 min x 3次；

        5.血清封閉：切片滴加血清放入濕盒中，室溫20 min。甩干不洗；

        6.孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗，對照組滴加等量PBS，4℃冰箱過夜；

        7.加熒光二抗：PBS浸洗3次，每次3 min，吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量避光操作；

        8.復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS 4次洗去多余的DAPI；

        9.封片：防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察。

        好了，到這了，細(xì)胞樣本與組織樣本的免疫熒光操作就總結(jié)到這里啦！想學(xué)習(xí)免疫熒光技術(shù)操作的同學(xué)建議全文背誦哦，深入視頻學(xué)習(xí)請點(diǎn)擊：《IF/免疫熒光》，有需要免疫熒光代做、外包的老師歡迎留言呀~