細(xì)胞凋亡檢測(cè)
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)實(shí)施的一種程序性死亡，是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)實(shí)施的一種程序性死亡，是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
【技術(shù)原理】
AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。因此Annexin V作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將AnnexinⅤ進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙錠（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Step1：細(xì)胞培養(yǎng)
Step2：轉(zhuǎn)染或藥物處理
Step3：細(xì)胞收集
Step4：加凋亡試劑
Step5：上機(jī)檢測(cè)
案例展示
A) control組； B) 處理組low； C) 處理組middle； D) 處理組high
左下象限LL為活細(xì)胞；右下象限LR為早期凋亡細(xì)胞，右上象限UR為晚期凋亡；左上象限UL為碎片及死亡細(xì)胞。
常規(guī)凋亡率可計(jì)算UR+LR
技術(shù)總結(jié)
1、考慮到進(jìn)行流式時(shí)需要用到對(duì)照組細(xì)胞設(shè)置空白組（用于調(diào)節(jié)電壓）和單染組細(xì)胞（用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償），因此要求該組細(xì)胞量較其他組多；
2、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度偏低，細(xì)胞量較少，則適當(dāng)增加離心時(shí)間。收集細(xì)胞時(shí)，應(yīng)該連同上清一起收集，同時(shí)胰酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則容易引起假陽性；
3、檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染等處理后可能會(huì)帶有自發(fā)熒光，應(yīng)注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如：帶綠色熒光時(shí)，應(yīng)選擇7AAD試劑盒；
4、細(xì)胞鋪板應(yīng)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好的時(shí)候進(jìn)行，且避免反復(fù)吹打；
5、流式樣品檢測(cè)需提前2-3個(gè)工作日預(yù)約。 流式檢測(cè)細(xì)胞樣本：細(xì)胞樣品準(zhǔn)備時(shí)，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，不得使用細(xì)胞刮刀進(jìn)行操作，胰酶消化細(xì)胞時(shí)切忌消化過頭或沒有完全打開細(xì)胞間隙；
6、由于細(xì)胞活性問題，只接受活細(xì)胞樣本，當(dāng)天完成實(shí)驗(yàn)。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 運(yùn)輸條件 |
|---|---|---|
| 組織 | 離體后組織制成單細(xì)胞懸液，加入PBS培養(yǎng)基內(nèi) | 常溫運(yùn)輸 |
| 活細(xì)胞 | 樣本量：1*106個(gè)細(xì)胞/TEST，加入PBS培養(yǎng)基內(nèi) | 常溫運(yùn)輸 |
| 血液 | 將血液采集在EDTA肝素鈉的抗凝采血管內(nèi) | 常溫運(yùn)輸 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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